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Zhuang Q. et al: NCoR/SMRT co-repressors cooperate with c-MYC to create an epigenetic barrier to somatic cell reprogramming

NCoR/SMRT共抑制子與c-MYC合作為體細胞重編程創造表觀遺傳屏障

發表期刊:Nature Cell Biology

中科院分區:1區

影響因子:28.213

發表時間:2018年

合作單位:中國科學院再生生物學重點實驗室

運用技術:免疫共沉淀(Co-IP)MS(由輝駿生物提供技術支持,點擊查看服務詳情)


● 研究背景

強制性表達已定義的外源因子(最初是OCT4,SOX2,KLF4和c-MYC(OSKM)可將體細胞重編程為誘導多能干細胞(IPSC)。在重編程開始時,外源OSKM與整個基因組的DNA結合,并誘導連續幾輪染色質重組,從而激活整個多能性基因網絡。然而,OSKM不是孤立運作的,需要共同的調節者來改變局部的表觀遺傳環境。盡管有關重編程中的轉錄和表觀遺傳反應的研究越來越多,但有關OSKM和不同的轉錄共調節因子(共激活因子和共抑制因子)如何相互作用或拮抗以誘導多能狀態目前仍知之甚少。

 

● 研究結果

1. NCoR/SMRT共抑制子為OSKM重新編程設置了障礙

首先,研究者檢測了NCOR1(編碼NCoR)和Ncor2(編碼SMRT)在小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)、胚胎干細胞(ESC)和OSKM重編程細胞中的表達。結果顯示,這兩種共抑制因子在三種細胞類型中都有表達。接下來,研究者敲除了用OSKM逆轉錄病毒轉導的OG2 MEF中的NCOR1/2,結果顯示敲除任何一個共抑制子都能顯著增加Oct4綠色熒光蛋白陽性(Oct4-GFP+)集落的數量(圖1A,B),而且集落出現得更快(圖1C)。抑制NCOR1/2增強了使用不同介質(包括高效率介質)的OSKM的重新編程,而與轉導方法、報告系統或MEF的類型無關。為了解NCoR和SMRT是如何阻止重編程的,研究者在OSKM重編程的第5天和第9天對血清+VC中的NCOR1/2耗盡細胞進行了RNA-seq(圖1E),兩種基因敲除中差異表達的基因相似(圖1E),但Ncor2基因敲除的整體效應更強(圖1E)。NCOR1/2敲除后,許多富含MEF的體細胞基因在第5天被上調,在第9天變得不明顯(圖1F),而與間充質向上皮轉化相關的基因在這兩個時間點都沒有受到影響。在第9天時,還出現了多能相關基因的上調。這些結果表明,在OSKM重編程中敲除NCOR1/2首先導致體細胞基因抑制的暫時性缺陷,然后加速和更有效地激活多能性基因。

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圖1


2. NCoR/SMRT共抑制器需要HDAC3來破壞重新編程

NCoR和SMRT作為連接轉錄因子和表觀遺傳修飾因子的對接平臺來調節染色質,包括不同的組蛋白脫乙酰酶(HDAC)家族成員。HDAC是調節NCoR/SMRT對OSKM重編程的有害影響的良好候選者,因為泛HDAC抑制劑如丙戊酸(VPA)或曲古菌素(TSA)可促進重編程。研究者觀察了HDAC1到HDAC11在MEF、ESC和OSKM介導的重編程過程中的表達。HDAC8、9、10和11在這三種細胞類型中都不表達,而HDAC7只在MEF和重編程期間表達,在ESC中表達下調,HDAC1到HDAC6在三種細胞類型中都有表達(圖2A)。接下來,研究者敲除了OSKM重編程中HDAC的表達(圖2B),HDAC3敲除顯著增加了重新編程,而在其他HDAC中,只有HDAC2敲除可以增強重新編程(圖2B)。相反,HDAC4、5和7被敲除會損害重編程(圖2B),另外兩個針對HDAC3的ShRNA也提高了重編程效率(圖2C)。此外,VPA沒有與HDAC3敲除協同促進重編程(圖2C),這表明PAN-HDAC抑制劑通過抑制HDAC3促進OSKM重編程。

 

研究者使用一個脫乙酰酶零突變體HDAC3(HDAC3-YF)和一個雙突變體HDAC3 (HDAC3-YF-Ka)(圖2D)進行了過表達實驗,選取HDAC1(HDAC1-YF)和HDAC2(HDAC2-YF)對照。過表達HDAC1-YF和HDAC2-YF適度促進了OSKM重編程(圖2E),而HDAC3-YF有效地增強了OSKM重編程(圖2F),重要的是,HDAC3-YF-KA突變體中HDAC3-YF對重編程的促進作用在HDAC3-YF-KA突變體中消失,表明HDAC3-YF需要與NCoR/SMRT相互作用,才能作為HDAC3的顯性負值(圖2D,E)。這些結果表明,HDAC3介導NCoR/SMRT對OSKM重編程的負效應,這一功能需要脫乙酰酶活性,但抑制NCoR/SMRT和HDAC3對體細胞基因的影響并不相同。后者或許可以用以下事實來解釋:目標位點的NCoR/SMRT耗盡會抑制其他酶活性,也可能招募共同激活者。

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圖2

 

3. 在重編程過程中,HDAC3誘導組蛋白在限制性基因組位點去乙酰化

為了了解HDAC3是如何損害OSKM重編程的,研究者通過免疫印跡分析了MEF、ESC和OSKM重編程中間產物中組蛋白H3乙酰化(AcH3)和組蛋白H4乙酰化(AcH4)的總水平。結果顯示,胚胎干細胞的AcH3和AcH4水平均高于MEF(圖3A),且在VPA或TSA增強的OSKM重新編程中,AcH3和AcH4的水平均有增加(圖3A,B)。然而NCoR/SMRT的缺失或HDAC3-YF的過表達并沒有進一步增加AcH3或AcH4的水平,且受NCoR/SMRT-HDAC3調控的兩個具有代表性的乙酰化組蛋白標記H3K27ac和H4K12ac也出現了同樣的情況(圖3C,D)。CHIP-Seq實驗表明,NCoR/SMRT-HDAC3復合體在特定的細胞環境中以總基因組的一小部分為靶標。接下來,研究者測量了所有轉錄起始位點(TSS)的H3K27ac水平,結果表明HDAC3-YF過表達對OSKM重編程中H3K27ac水平的影響是直接的。這些結果表明,HDAC3可能作為NCoR/SMRT復合體的一部分,通過在包括多能位點在內的限制性位點誘導組蛋白去乙酰化來損害OSKM重編程。

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圖3

 

4. NCoR/SMRT在重編程中對多能性位點的上下文特定招募

研究者對第9天OSKM重編程進行了CHIP-Seq,以研究NCoR/SMRT是否被招募到多能位點,通過HDAC3誘導組蛋白去乙酰化。結果顯示,很大一部分NCoR/SMRT結合峰在重新編程(76%)和ESC(56%)中共享(圖4A,B)。GO分析表明,在第5組和第15組,尤其是第5組,NCoR/SMRT結合位點在干細胞相關術語中得到豐富,而在第7組中,NCoR/SMRT結合位點在分化相關術語中得到豐富(圖4C)。NCoR/SMRT僅在重編程期間才被招募到多能性基因座Sox2和Prdm4 ,這些基因座在重編程中顯示出比ESC中更低的H3K27ac水平(圖4D)。ChIP-qPCR技術證實了NCoR/SMRT在重編程時與Nanog和Utf1啟動子結合,在ESC中的結合程度較小(圖4E),而在MEF中幾乎沒有NCoR/SMRT結合。這些結果表明,NCoR/SMRT招募到多能位點會使重編程脫軌,而在ESC中,這些共抑制因子具有不同的功能,可能與發育過程中的組織規格有關。

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圖4


研究者為模擬多能性狀態,探究HDAC3-YF過表達是否有助于增加NCoR/SMRT靶基因位點的H3K27ac水平,在重新編程的第5、9和13天測量了所有NCoR/SMRT結合位點的H3K27ac水平,并在重新編程的第9天測量了所有NCoR/SMRT結合位點的ESC水平。結果顯示,對于所有被NCoR/SMRT結合的位點,早期重新編程時間點的H3K27ac水平較低,尤其是在HDAC3-YF和ESCS中,在第13天升高(在第9天則降低)(圖5A)。在對NCoR / SMRT結合組5和15(圖5B,C)進行重編程時測量H3K27ac水平以及在重編程中被NCoR / SMRT結合的“第二波”基因中檢測到了相似的結果(圖5D)。此外,為了研究HDAC3-YF對NCoR/SMRT結合位點H3K27ac水平的增強作用是否與基因表達增加有關,我們對NCoR/SMRT結合的一組多能性相關基因(包括許多“第二波”基因)在TSS的2kb范圍內進行了RT-qPCR。結果顯示NCoR/SMRT結合、重編程第13天H3K27ac水平升高(第9天較低)與HDAC3-YF過表達時基因表達增加之間有很好的相關性(圖5E),在NCOR1/2基因敲除時也得到了類似的結果。相比之下,在重新編程的第9天,一組在ESC中的表達高于MEF的第二波基因,在TSS的20kb范圍內沒有NCoR/SMRT結合,在HDAC3-YF的第9天或第13天,H3K27ac水平幾乎或沒有增加。然而,ESC中這些位點的H3K27ac水平明顯低于第5組和第15組(圖5B,C)。胚胎干細胞在某些發育基因上顯示出適度的H3K27ac水平,這使得它們能夠在分化過程中迅速激活。這些結果證實了NCoR/SMRT通過HDAC3介導組蛋白去乙酰化來抑制多能性基因的重新激活。

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圖5

 

5. c-MYC在重新編程時招募了NCoR / SMRT–HDAC3復合體      

外源OSKM因子是將NCoR/SMRT-HDAC3募集到DNA的有力候選者。HEK293T細胞中的免疫共沉淀證實了OSK與NCoR / SMRT的相互作用,但與c-MYC的結合更強(圖6A)。值得注意的是,這種c-MYC-NCoR/SMRT間的相互作用需要NCoR和SMRT的氨基末端結構域(圖6B,C),這是行使抑制功能所必需的。在OSKM重編程的第9天,研究者用外源性c-MYC和內源性HDAC3在血清+VC中免疫共沉淀NCoR和SMRT的N端(圖6D),結果顯示,外源性c-MYC可以共沉淀內源性HDAC3(圖6E)。ChIP-seq分析發現,NCoR/SMRT中還存在著一個c-MYC結合基序(圖6F)。此外,NCOR1/2基因敲除未能提高OSK(圖6G)的重編程效率,HDAC3-YF的表達對OSK(圖6H)的重編程也沒有有利影響。

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圖6


為研究NCoR/SMRT和c-MYC結合位點之間的全基因組相關性,研究者比較了NCoR/SMRT的結合與OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的結合情況(圖7A)。IPSC前體是穩定的克隆細胞系,在OSKM重編程中經常出現,它經歷了重新編程的初始階段,但是未能激活多能網絡。在IPSC前體中,NCoR/SMRT與OSKM的重疊最強的是c-MYC,其次是KLF4和OCT4/SOX2(圖7B,C)。IPSC前體的NCoR / SMRT和KLF4之間的大部分重疊位點都被c-MYC結合(圖7D),但是這些位點中的很大一部分在這三個重編程因素之間共享(圖7E-G)。因此,在四個山中因子中,c-MYC主要有助于將NCoR / SMRT募集到基因組位點(包括多能性位點),從而對重編程產生負面影響。

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圖7

 

6. 外源c-MYC在重編程中的雙重作用

為了進一步評估c-MYC和NCoR/SMRT在重編程中抑制多潛能基因的關系,研究者構建了由Oct4末端增強子(Oct4-DE)驅動的DsRed慢病毒報告程序(圖8A)。該報告整合到基因組中,可以通過多能轉錄因子的結合直接激活,而無需進行完全重編程。OCT4、SOX2或KLF4在MEF中的單獨過表達略微激活了報告因子,但它們的組合具有協同作用(圖8B,C)。相比之下,c-MYC單獨沒有激活作用,但與OSK結合使用會削弱報告基因活性的增加(圖8B,C)。研究者進一步用OSK和多西環素誘導的c-MYC重新編程MEF(圖8D)。從第3-9天開始誘導c-MYC導致干細胞標記堿性磷酸酶陽性的菌落數量達到峰值,這在重新編程中相對較早出現,而如果在整個實驗過程中誘導了c-MYC,則這種增加不會進一步改變(圖8E)。c-MYC誘導后第3天至第9天Oct4-GFP+集落數量也達到高峰,但隨著誘導時間的延長,Oct4-GFP+集落數量明顯減少(圖8F)。這些結果都表明,VP16工程轉錄因子提高重編程效率的一個機制是通過抵消由OSKM,特別是c-MYC招募的NCoR/SMRT共抑制子對多能性位點的負面影響。

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圖8


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