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Wang W.T. et al: The lncRNA LAMP5-AS1 drives leukemia cell stemness by directly modulating DOT1L methyltransferase activity in MLL leukemia

中文標題:lncRNA LAMP5-AS1調節白血病細胞干性

發表期刊:Journal of Hematology & Oncology

中科院分區:1區

影響因子:23.168

發表時間:2020年

合作單位:中山大學生命科學學院

運用技術:RNA pull down MS結合蛋白鑒定(由輝駿生物提供技術支持,點擊查看服務詳情)



● 研究背景

混合系白血病(MLL)基因重排引發造血干/祖細胞異常的表觀遺傳修飾和基因表達,使其成為最具侵襲性的白血病亞型之一。MLL基因可以與60多個伙伴重組,直接抑制MLL重排本身顯然是困難的。因此,了解MLL白血病細胞如何促進自我更新和阻滯分化的機制才能提供新的治療策略。

 

● 研究結果

1. LAMP5-AS1是維持抗MLL白血病細胞分化的自我更新能力所必需的

LAMP5-AS1是起源于20號染色體上溶酶體相關膜蛋白5(LAMP5)編碼基因反義鏈上的lncRNA。研究者在大量臨床樣本的分析中發現了LAMP5-AS1在MLL白血病中的高表達(圖1A)。取4例MLL白血病患者骨髓進行原代細胞培養,其中包括3例急性淋巴細胞白血病和1例急性髓系白血病。LAMP5-AS1基因敲除后,原代細胞被顯著誘導向淋巴細胞或單核/巨噬細胞分化(圖1B),集落形成能力顯著減弱(圖1C),白血病干細胞和祖細胞的分化水平增加(圖1D),細胞的增殖和自我更新能力嚴重受損(圖1E),分化急劇增加(圖1F)。這些結果表明,敲除LAMP5-AS1基因可顯著抑制MLL白血病細胞的自我更新能力,促進其分化,提示著LAMP5-AS1基因在MLL白血病的發生發展中起著一定的作用。

RNA pull down MS結合蛋白鑒定-客戶文獻-輝駿生物.png

圖1

2. LAMP5-AS1促進MLL白血病進展

接著,研究者將轉染shLAMP5-AS1的MOLM13細胞和對照細胞(sh-NC)注射到NOD/SCID小鼠尾靜脈,建立了異種移植模型,進一步探究LAMP5-AS1在體內對MLL白血病發生過程的影響。H&E染色檢測LAMP5-AS1基因敲除對小鼠臟器浸潤的調節作用。結果顯示,與sh-NC組小鼠相比,轉染sh-LAMP5-AS1的小鼠骨髓、脾臟和肝臟中的MLL白血病細胞數量明顯減少(圖2A),器官浸潤能力顯著降低(圖2B,C),分化標記CD11b、CD14(圖2D,E)和顯著的分葉狀核型顯著增加(圖2F),小鼠存活時間更長(圖2G),MOLM13細胞的自我更新頻率顯著降低(圖2H)。這些結果表明,LAMP5-AS1是一種在MLL白血病中特異性高表達的lncRNA,對MLL白血病促進自我更新能力和抑制分化是必需的。

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圖2

 

3. LAMP5-AS1與H3K79甲基轉移酶DOT1L在其催化區富含賴氨酸的區域直接結合

研究者通過RNA pull-down和質譜分析鑒定與LAMP5-AS1相互作用的蛋白質,其中組蛋白甲基轉移酶DOT1L引起了研究者的興趣,DOT1L被MLL融合蛋白招募,導致HOXA基因、MEIS1基因和其他基因的表觀激活,在MLL白血病的發生發展中起著重要作用。為了驗證LAMP5-AS1可能通過與DOT1L相互作用而發揮作用的這一假設,研究者先后通過RNA pull-down和RIP實驗分別驗證了二者之間的相互作用和這種相互作用的特異性(圖3A,B)。為了進一步探究LAMP5-AS1是如何與DOT1L結合的,以及它是否有可能影響組蛋白甲基轉移酶的功能,研究者接下來用DOT1L或LAMP5-AS1截斷的突變體進行了實驗。最終結果表明,LAMP5-AS1與DOT1L催化結構域的390-407aa區域(一個富含賴氨酸的區域,對于DOT1L(1-416aa)催化H3K79甲基化非常重要)特異性結合(圖3D-I)。

 

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圖3


4. LAMP5-AS1對DOT1L甲基轉移酶活性的影響

接下來,研究者通過無細胞組蛋白甲基轉移酶(HMTase)檢測了LAMP5-AS1是否通過與其催化結構域的富含賴氨酸區結合而影響DOT1L甲基轉移酶的活性。分別通過體外轉錄和原核表達系統獲得了純化的LAMP5-AS1和重組GST標記的1-416aa DOT1L(圖4A,b),從HeLa細胞中分離的核小體,以及S-腺苷蛋氨酸用于HMTase分析(圖4C)。結果發現,DOT1L-LAMP5-AS1復合物具有更高的甲基轉移酶活性,且lncRNA具有刺激高階H3K79甲基化的能力(圖4D)。進一步進行電泳遷移率改變分析(EMSA),鑒定出了LAMP5-AS1(503-764nt)和DOT1L(1-416aa)之間的直接相互作用(圖4E)。這些結果表明,LAMP5-AS1通過增強DOT1L的甲基轉移酶活性來促進MLL白血病細胞的自我更新能力。

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圖4

 

5. LAMP5-AS1調控MLL融合蛋白靶基因H3K79me2/3的全局模式   

鑒于LAMP5-AS1通過直接與N端催化結構域結合而促進DOT1L的甲基轉移酶活性這一特點,研究者進行了一系列后續實驗探究LAMP5-AS1是否能影響H3K79me2/3的全基因組水平。Western blotting分析顯示,敲除LAMP5-AS1導致MOLM13細胞和原代MLL白血病細胞中H3K79me2和H3K79me3的水平顯著降低(圖5A,B),這表明LAMP5-AS1可能是H3K79甲基化狀態較高的關鍵因素。ChIP分析證實了在LAMP5-AS1被沉默后,HOXA9、HOXA10和Meis1基因體上H3K79me2/3的下調(圖5D-F)。研究者還進行了129個MLL-AF9靶基因的薈萃分析(圖5G),和MLL融合蛋白核心靶基因的表達模式(圖5H),最終結果表明,LAMP5-AS1通過上調H3K79me2/ME3和DOT1L異位靶基因轉錄促進MLL白血病細胞自我更新和阻滯分化。

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圖5

 

6. LAMP5-AS1可作為MLL白血病不良預后的預測因子  

最后,為評估LAMP5-AS1的臨床相關性,研究者重新分析了419例患者樣本,結果顯示LAMP5-AS1在這些組之間存在差異表達,且在MLL白血病中的表達水平最高(圖6A),進一步檢測了7例配對MLL白血病患者,結果顯示與MLL融合蛋白水平呈顯著正相關的LAMP5-AS1在CR樣本中的表達與初步診斷樣本相比顯著降低(圖6B)。這些結果提示LAMP5-AS1的特異性上調可能是MLL白血病的一個有用的生物標志物。隨后,ROC曲線分析和生存率分析也證明,LAMP5-AS1的高表達與MLL白血病患者的預后不良密切相關,表明該lncRNA可作為MLL白血病未來診斷和預后的生物標志物(圖6C,D)。

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圖6


結論:

研究結果表明,lncRNA LAMP5-AS1在MLL白血病細胞的自我更新過程和分化阻滯中起著重要的作用。LAMP5-AS1對維持DOT1L在MLL白血病中的高酶活性具有重要意義,可能成為治療MLL白血病的一個有價值的靶點。


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