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Jiang, S. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP

中文標題:固醇通過APMAP抑制EGFR降解誘導前列腺癌細胞上皮向間質轉化

發表期刊:Cancer Research

中科院分區:1區

影響因子:13.312

發表時間:2019年4月

合作單位:中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所

運用技術:Co-IP-MS/MS,生物信息學分析(由輝駿生物提供技術支持,點擊查看詳情)



● 研究背景

相比于局限性前列腺癌,轉移性前列腺癌無疑是致命的。近來已有報道表明,膽固醇與前列腺癌的發展有關,并可能成為前列腺癌的診斷標記物和治療靶點。脂肪細胞質膜相關蛋白(APMAP)是一種跨膜蛋白,在脂肪細胞分化和肥胖過程中被特異性誘導,EGFR底物15相關蛋白(EPS15R)被報道可調節EGFR的內化。了解膽固醇在前列腺癌轉移中的作用及具體機制,才能夠為前列腺癌的治療提供新的策略。

 


● 研究結果

1. 膽固醇誘導前列腺癌細胞EMT的發生依賴于ERK1/2的激活

研究者分別對加膽固醇和不加膽固醇處理的前列腺癌細胞進行了EMT標志物檢測,結果顯示膽固醇處理增加了EMT標志物的遷移、侵襲和表達(圖1A-D)。通過對幾種調控EMT的信號通路的檢測以及后續的ERK1/2抑制劑實驗,發現膽固醇治療下增加的細胞遷移和侵襲在兩種ERK抑制劑治療后發生逆轉,這表明ERK信號通路在膽固醇誘導的前列腺癌細胞EMT中是必不可少的(圖1E-H)。

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圖1


2. 膽固醇促進EGFR和APMAP在脂筏中的積聚

研究者對膽固醇處理下的差異表達基因進行了進一步的GO分析和通路分析,結果顯示,這些基因聚集在EGFR、WNT和VEGF信號通路中,這些信號通路都與EMT,此外,GO分析表明膽固醇可能參與了膜筏相關的過程(圖2A-B)。LC-MS/MS分析膽固醇處理前后PC-3細胞脂筏蛋白表達的變化,發現ERK1/2的上游調節因子EGFR和結直腸癌轉移有關的APMAP在膽固醇處理后的脂筏中均有增加(圖2D)。為進一步確定APMAP是否參與EGFR的積聚,將EGFR-RFP載體轉染至APMAP缺失的PC-3細胞和對照細胞,然后用膽固醇處理。在對照細胞中,膽固醇增強了EGFR-RFP的熒光;然而當APMAP被敲除后,膽固醇對EGFR的影響幾乎完全被抑制(圖2F)。同時,APMAP的敲除削弱了EGFR的積累,從而降低了膽固醇誘導ERK1/2的磷酸化(圖2G)。這些數據表明,APMAP增加了前列腺癌細胞中由膽固醇誘導的EGFR的蛋白水平。

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圖2


3. APMAP通過EGFR促進前列腺癌細胞EMT

接下來,研究者對APMAP基因敲除后的差異表達基因進行了進一步的GO分析和KEGG通路分析,這些基因與類固醇生物合成和膽固醇代謝過程聚集在一起(圖3A),這表明APMAP和膽固醇可能有重疊的功能。APMAP基因敲除顯著抑制了膽固醇誘導的細胞遷移、侵襲能力和EMT過程(圖3B-D)。相反,APMAP的過表達促進了遷移和侵襲,而EGFR抑制劑則抑制了這一效應(圖3E,F)。此外,EGFR抑制劑顯著抑制了ERK1/2的激活,并抑制了APMAP過表達細胞中EMT標志物的表達(圖3G)。體內實驗的結果與之類似,與對照組相比,注射膽固醇組的細胞明顯形成更多的肝轉移結節。膽固醇組的轉移瘤組織中,EGFR mRNA、APMAP和Vimentin的表達水平均顯著高于對照組,APMAP基因敲除顯著降低了它們的表達水平(圖3J,K)。這些數據表明APMAP通過調節EGFR參與膽固醇誘導的EMT過程。

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圖3

 

4. 膽固醇通過APMAP降低EGFR的內化

qRT-PCR分析發現膽固醇對EGFR的轉錄水平沒有影響(圖4A),這說明APMAP對EGFR水平的調節發生在翻譯之后。EGFR的降解依賴于內化,研究者推測膽固醇對EGFR降解的抑制是通過EGFR的內化實現的。共聚焦顯微鏡顯示,在膽固醇處理下,EGFR和早期內體標記Rab5在兩個細胞中的共存減少(圖4D,E);APMAP-G FP與Rab5-RFP的共存增加(圖4F)。轉染EGFR-GFP/Rab5-RFP和APMAP-GFP/Rab5-RFP至PC-3細胞,膽固醇處理后,APMAP沉默的細胞中EGFR與Rab5的共存增加(圖4G)。這些數據表明,APMAP調節膽固醇介導的EGFR的穩定性。

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圖4

 

5. APMAP通過與EPS15R相互作用抑制EGFR內化

使用Co-IP和LC/MS-MS分析來確定APMAP的結合伙伴,對檢測到的APMAP結合蛋白進行了GO富集和途徑分析,數據表明APMAP參與了囊泡的輸注和囊泡介導的轉運。由于EPS15R參與EGFR的內化,研究者首先通過Co-IP證實了內源性APMAP與EPS15R的相互作用(圖5C),發現EPS15R的蛋白水平不受膽固醇的影響(圖5D),且質膜免疫熒光顯示,這種相互作用通過膽固醇治療得到加強(圖5F),并與EGFR解離(圖5G)。根據這些結果,研究者推測EPS15R在APMAP介導的EGFR降解中起關鍵作用。為驗證假設,研究者進行了APMAP沉默和/或EPS15R沉默的膽固醇處理的DU145細胞中EGFR和Rab5的免疫染色,結果顯示,APMAP沉默促進EGFR向早期內體募集的作用被EPS15R的沉默)所阻斷(圖5H)。在有膽固醇存在的APMAP耗竭沉默的細胞中,EGFR的蛋白水平因EPS15R的耗竭而恢復(圖5I)。這些結果表明,APMAP通過與EPS15R結合,抑制EGFR內化到早期內小體,從而影響膽固醇誘導的EGFR蛋白穩定性。

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圖5

 

6. APMAP在前列腺癌中顯著上調

為了了解APMAP在惡性腫瘤中的作用,研究者對15種癌癥中APMAP的轉錄水平進行了生物信息學分析,發現前列腺癌組織中APMAP的表達均顯著高于鄰近正常組織(圖6B)。ROC曲線分析顯示APMAP表達在預測前列腺癌組織與正常組織的敏感性和特異性(圖6C)。為探討APMAP在前列腺癌組織和正常組織中的表達情況,對80例前列腺癌患者和8例正常對照的組織芯片標本進行免疫組化染色。結果顯示與正常組織相比,前列腺癌組織中APMAP蛋白的表達增加(圖6D)。APMAP在腫瘤中的表達明顯增高,說明APMAP可作為前列腺癌的潛在診斷標記物。

 

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         圖6


輝駿生物實驗外包服務商,10年專注科研實驗,專業提供全方位等科研服務。輝駿自有蛋白質檢測平臺,對CoIP產物等微量蛋白的質譜鑒定有充足的把控能力,對后續的生物信息分析有獨到的見解。


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