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RNA免疫沉淀(RIP)* 實驗原理


RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RNA結合蛋白免疫沉淀)是研究體內 RNA 與蛋白結合情況的技術。

結合了抗體的磁珠或樹脂(Beads)與樣本裂解液孵育,通過”抗原-抗體“之間的免疫作用,誘餌蛋白被吸附在Beads上,與誘餌蛋白結合的RNA,也一起沉淀到Beads上。洗滌去掉未結合的RNA后,再用洗脫液將RNA-蛋白復合物從Beads洗脫下來,便得到RNA免疫沉淀產物。RIP產物既可以用qPCR檢測已知RNA,也可以用二代測序檢測未知RNA。

當沒有合適的誘餌蛋白抗體時,可以通過表達融合了flag標簽的誘餌蛋白,利用flag標簽做免疫沉淀。即細胞過表達Flag-Bait,經裂解后與anti-Flag珠子孵育,誘餌融合蛋白與Beads結合,與誘餌融合蛋白互作的RNA“共沉淀”到Beads上,再經洗滌、洗脫后做qPCR或NGS測序。



輝駿生物10年科研服務經驗,專業提供分子互作實驗服務,包括蛋白與蛋白、蛋白與DNA、蛋白與RNA、RNA與RNA的相互作用技術,經驗豐富,實驗結果穩定、可靠。

我公司自有分子、細胞和質譜實驗平臺,能執行最優的實驗路線,對微量互作蛋白的質譜鑒定有充足把控力,對后續功能分析有獨到見解。

我們不僅會提供專業的售前方案建議、而且售后技術支持將一直保持到文章發表,確保您安心進行下游實驗及投稿

目前,客戶已在Nature子刊、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功發表大量高分文章(點擊查看客戶文獻)





RNA免疫沉淀(RIP)* 實驗流程

RIP實驗,RNA結合蛋白免疫共沉淀,RIP-seq檢測實驗.jpg
內源蛋白的RNA免疫共沉淀流程圖


RIP-qPCR,rip技術實驗,rip實驗外包.jpg

標簽融合蛋白的RNA免疫共沉淀流程圖





RNA免疫共沉淀(RIP)* 應用背景


RNA結合蛋白(RNA binding protein,RBP)是一類功能強大而廣泛的調節因子,約占細胞編碼的所有蛋白的5%~10%。目前除了少數RNA以核酶形式單獨發揮功能,大部分RNA通過與蛋白結合形成RNA-蛋白復合物來發揮作用。


一方面,RBP參與RNA合成、可變剪接、修飾、轉運、翻譯及胞內定位等多個轉錄后調控過程,調控mRNA穩定性、lncRNA活性、miRNA沉默復合體形成等生物學過程;另一方面,RNA也會調節這些蛋白質的活性、定位或與其他蛋白質的相互作用,從而影響RBP介導的各種細胞事件。RNA與蛋白質的相互作用對于維持細胞穩態是非常重要的,干擾這種相互作用將會導致細胞功能失調和相關疾病的發生。


目前研究RNA-蛋白質相互作用的方法分為兩大類:一是以感興趣的RNA為中心,尋找與該RNA結合的蛋白質;二是以感興趣的蛋白質為中心,尋找與該蛋白質結合的RNA。RIP(RNA免疫共沉淀)屬于后者,利用特異性的抗體捕獲樣本中的目標蛋白,那么與目標蛋白結合的RNA也一并被捕獲,之后通過qPCR或者測序技術來確定這些結合的RNA。

 

聯系技術支持
18927549347、13430303037



RNA免疫共沉淀(RIP)* 輝駿服務內容


服務項目
服務內容結果交付實驗周期客戶提價格

RIP qPCR

(驗證型)

Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖5-6周

實驗樣本

誘餌蛋白的IP級抗體

實驗信息表(樣本信息,誘餌蛋白序列)



RIP調取誘餌蛋白及其結合的RNA

(2組:實驗組和對照組)

誘餌蛋白Western blot檢測圖

待測RNA的qPCR檢測數據

RIP實驗報告

RIP seq

(篩選型)

Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖5-6周

實驗樣本

誘餌蛋白的IP級抗體

實驗信息表(樣本信息,誘餌蛋白序列)





RIP調取誘餌蛋白及其結合的RNA

(2組:實驗組和對照組)

誘餌蛋白Western blot檢測圖

RIP實驗報告

seq檢測和分析

(2組:實驗組和input)

seq檢測結果

檢測和分析報告

9周




RNA免疫共沉淀RIP * 樣本要求


樣本類型

RIP 建議送樣量

RIP 建議送樣量

動物細胞3*10e7個細胞/組(約3個10cm皿)5*10e7個細胞/組(約5個10cm皿)
動物組織1g/組2g/組
植物葉片2g/組4g/組
植物根或果實4g/組8g/組
菌體50ul菌體沉淀/組100ul菌體沉淀/組

▲注意:這里列出的均為每組樣本的送樣量,如果實驗和對照組用的樣本一致,此樣本量*2。詳細送樣指南可聯系輝駿生物客服或銷售索取。

 保存及運輸:-80℃保存,干冰取樣/運輸,至少在送樣前2天通知我司。


 


RNA免疫共沉淀RIP * 結果示例


RIP整理圖.jpg

RIP-qPCR:誘餌蛋白western blot檢測圖



Normalized to Input

GAPDH

B基因-引物1B基因-引物2
Input1
11
IgG_RIP0.00%0.00%0.00%
A蛋白_RIP0.00%0.90%0.78%

Normalized to IgG

GAPDH

B基因-引物1

B基因-引物2

IgG_RIP111
A蛋白_RIP3.053241.241
314.227


RIP-qPCR:待測基因和內參基因檢測數據



RIP-%input2.jpg

RIP組相對于input組的富集圖(% input)



RIP-IP enrich2.jpg

RIP組相對于IgG組的富集圖


聯系技術支持
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RNA免疫共沉淀RIP * 客戶服務案例


Han H. et al: Long noncoding RNA PART1 restrains aggressive gastric cancer through the epigenetic silencing of PDGFB via the PLZF-mediated recruitment of EZH2. 

Oncogene. 2020. (IF=9.867)


lncRNA PART1通過PLZF介導的EZH2募集導致PDGFB表觀遺傳沉默來抑制侵襲性胃癌



研究概述

以往研究顯示,一種長鏈非編碼RNA(LncRNA)“PART1”在某些癌癥中有抑癌作用,在某些癌癥中又有致癌作用。人類胃癌組織的GEO芯片數據顯示,lncRNA PART1在胃癌中顯著下調,TCGA數據庫和GEPIA數據庫信息顯示低水平的lncRNA PART1更容易導致腫瘤轉移和患者生存期縮短;但其臨床意義和潛在機制尚未明確。本研究發現的PART1作用機制是:PART1與AR相互作用,以雄激素非依賴性的模式激活腫瘤抑制因子PLZF,之后PLZF蛋白和EZH2蛋白相互作用,導致PI3K-Akt通路基因PDGFB的啟動子發生H3K27me3修飾,從而使促癌基因PDGFB的轉錄活性受到抑制。



研究路線

細胞、CAM和小鼠實驗均表明PART1水平與胃癌的惡性程度、轉移能力呈負相關
RNA-seq實驗發現高表達的PART1下調了PI3K-Akt通路的一些基因,上調了腫瘤抑制基因PLZF,腫瘤組織檢測和TCGA數據庫資料確定了該結果
RNA pulldown結合質譜鑒走技術首次發現了PART1的潛在結合蛋白——AR(已有研究表明AR可以激活前列腺瘟中的PLZF并抑制其增殖
RNA pull down WBRIP qPCR實驗確定了PART1與AR的相互作用
ChIP雙熒光素酶實驗表明AR與PLZF啟動子的2個位點結合,PLZF啟動子因AR、PART1的單獨作用或兩者的協同作用而激活
數據庫調查和Co-IP結果均顯示PIZF蛋白與EZH2蛋白結合
ChIP-qPCR結果表明PI3K-Akt通路蛋白PDGFB的啟動子與PIZF、EZH2蛋白結合、且該區域發生H3K27me3修飾

功能回復實驗表明, PDGFB過表達可以部分回復PART1對GC細胞生長、遷移和侵襲、等能力的抑制




RNA免疫共沉淀RIP * 客戶文章


1. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA.Nature Methods,15(3): 213–220. 2018,IF=28.467.
【研究內容】:輝駿生物為作者單位之一,和作者共同開發了一種捕獲鑒定新生RNA結合蛋白的全新方法(RICK)。該方法用EU標記新生RNA,通過點擊反應-生物素-鏈霉親和素系統結合質譜分析,分離鑒定RNA互作蛋白。其中,METTL1和CDK1是兩個RICK獨有的RNA結合蛋白。 RIP-qPCR、RIP-Seq、CLIP-Seq等實驗進一步證實了它們與非PolyA RNA的結合,這種結合在細胞分化與增殖中發揮了重要作用。
使用相關技術RIP-qPCR、RNA免疫共沉淀RIP-Seq、RNA結合蛋白免疫沉淀技術


2. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters. Cell Research.2015, IF=13.9.

【研究內容】:客戶利用RNA pull down、CoIP等技術,發現lincRNA-p21與HNRNPK結合,并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成復合物,作者通過RIP-qPCR進一步證實了細胞中存在該復合物。該復合物甲基化了多能性基因的啟動子序列及相應組蛋白,并改變了它們的表達量,從而進一步影響體細胞重編程過程。

使用相關技術:RIP seq、RNA結合蛋白免疫共沉淀rip qpcr、質譜鑒定


3. Zhang C Y . et al: CircVPRBP inhibits nodal metastasis of cervical cancer by impeding RACK1 O-GlcNAcylation and stability. Oncogene. 2023, IF=8.756.

【研究內容】:淋巴結轉移是宮頸癌(CCa)患者最惡性的臨床特征之一。本研究利用RNA pull down、RIP和Co-IP等實驗發現:circVPRBP與OGT酶競爭結合RACK1蛋白,阻礙RACK1-S122位點的O-GlcNAc修飾來使其降解,從而抑制宮頸癌淋巴結轉移和淋巴管生成。

使用相關技術:RIP-qPCR、RNA pull down MS、免疫共沉淀Co-IP、質譜鑒定



輝駿生物RIP(RNA免疫共沉淀)服務內容


1. RIP-qPCR,用于檢測某樣本中的誘餌蛋白和待測RNA是否結合;

2. RIP-seq,用于篩選某樣本中的誘餌蛋白可以結合哪些RNA。


服務項目
服務內容結果交付實驗周期客戶提價格

RIP qPCR

(驗證型)

Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖5-6周

實驗樣本

誘餌蛋白的IP級抗體

實驗信息表(樣本信息,誘餌蛋白序列)



RIP調取誘餌蛋白及其結合的RNA

(2組:實驗組和對照組)

RIP實驗報告

誘餌蛋白Western blot檢測圖

待測RNA的qPCR檢測數據

RIP seq

(篩選型)

Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖5-6周

實驗樣本

誘餌蛋白的IP級抗體

實驗信息表(樣本信息,誘餌蛋白序列)





RIP調取誘餌蛋白及其結合的RNA

(2組:實驗組和對照組)

RIP實驗報告

誘餌蛋白Western blot檢測圖

seq檢測和分析

(2組:實驗組和input)

seq檢測結果

檢測和分析報告

9周



聯系技術支持
18927549347、13430303037



RIP(RNA免疫共沉淀)樣本要求



樣本類型

RIP 建議送樣量

RIP 建議送樣量

動物細胞3*10e7個細胞/組(約3個10cm皿)5*10e7個細胞/組(約5個10cm皿)
動物組織1g/組2g/組
植物葉片2g/組4g/組
植物根或果實4g/組8g/組
菌體50ul菌體沉淀/組100ul菌體沉淀/組

▲注意:這里列出的均為每組樣本的送樣量,如果實驗和對照組用的樣本一致,此樣本量*2。詳細送樣指南可聯系輝駿生物客服或銷售索取。

保存及運輸:-80℃保存,干冰取樣/運輸,至少在送樣前2天通知我司。





RNA免疫共沉淀RIP結果示例


Normalized to Input

GAPDH

B基因-引物1B基因-引物2
Input1
11
IgG_RIP0.00%0.00%0.00%
A蛋白_RIP0.00%0.90%0.78%

Normalized to IgG

GAPDH

B基因-引物1

B基因-引物2

IgG_RIP111
A蛋白_RIP3.053241.241
314.227


RIP qPCR檢測數據



RIP-%input2.jpg

RIP組相對于input組的富集圖(% input)



RIP-IP enrich2.jpg

RIP組相對于IgG組的富集圖


聯系技術支持
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RIP(RNA免疫共沉淀)服務優勢*輝駿生物



1

十年服務經驗,眾多服務案例,服務成果得到優秀期刊認可

2

可對圍繞RNA結合蛋白開展的整體課題提供全方位方案建議

3

自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執行最優的實驗路線

4

售后技術支持將一直保持到客戶發表文章,確保客戶安心進行下游實驗及投稿





RIP實驗客戶文章


1. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA.Nature Methods,15(3): 213–220. 2018,IF=28.467.
【研究內容】:輝駿生物為作者單位之一,和作者共同開發了一種捕獲鑒定新生RNA結合蛋白的全新方法(RICK)。該方法用EU標記新生RNA,通過點擊反應-生物素-鏈霉親和素系統結合質譜分析,分離鑒定RNA互作蛋白。其中,METTL1和CDK1是兩個RICK獨有的RNA結合蛋白。 RIP-qPCR、RIP-Seq、CLIP-Seq等實驗進一步證實了它們與非PolyA RNA的結合,這種結合在細胞分化與增殖中發揮了重要作用。
使用相關技術RIP-qPCR、RNA免疫共沉淀RIP-Seq、RNA結合蛋白免疫沉淀技術


2. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters. Cell Research.2015, IF=13.9.

【研究內容】:客戶利用RNA pull down、CoIP等技術,發現lincRNA-p21與HNRNPK結合,并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成復合物,作者通過RIP-qPCR進一步證實了細胞中存在該復合物。該復合物甲基化了多能性基因的啟動子序列及相應組蛋白,并改變了它們的表達量,從而進一步影響體細胞重編程過程。

使用相關技術RIP seq、RNA結合蛋白疫共沉淀rip qpcr、質譜鑒定


3. Zhang C Y . et al: CircVPRBP inhibits nodal metastasis of cervical cancer by impeding RACK1 O-GlcNAcylation and stability. Oncogene. 2023, IF=8.756.

【研究內容】:淋巴結轉移是宮頸癌(CCa)患者最惡性的臨床特征之一。本研究利用RNA pull down、RIP和Co-IP等實驗發現:circVPRBP與OGT酶競爭結合RACK1蛋白,阻礙RACK1-S122位點的O-GlcNAc修飾來使其降解,從而抑制宮頸癌淋巴結轉移和淋巴管生成。

使用相關技術:RIP-qPCR、RNA pull down MS、免疫共沉淀Co-IP、質譜鑒定


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RNA免疫共沉淀試劑盒(RIP試劑盒)信息


名稱
貨號規格
動物RIP試劑盒(Protein G 樹脂)         
FI870312 / 24 / 40次
動物RIP試劑盒(Protein A/G 磁珠)        
FI8709
12 / 24 / 40次
動物ChainFreeTM Flag-tag RIP試劑盒         
FI870412 / 24 次
動物ChainFreeTM HA-tag RIP試劑盒         
FI870512 / 24 次
動物ChainFreeTM Myc-tag RIP試劑盒         
FI870612 / 24 次
動物ChainFreeTM GFP-tag RIP試劑盒       
FI8707 
12 / 24 次
動物ChainFreeTM mCherry-tag RIP試劑盒         
FI870812 / 24 次
植物RIP試劑盒(Protein G 樹脂)        
FI871312 / 24 / 40次   
植物RIP試劑盒(Protein A/G 磁珠)         
FI871912 / 24 / 40次
植物ChainFreeTM Flag-tag RIP試劑盒         
FI871412 / 24 次
植物ChainFreeTM HA-tag RIP試劑盒         
FI871512 / 24 次
植物ChainFreeTM Myc-tag RIP試劑盒         
FI871612 / 24 次
植物ChainFreeTM GFP-tag RIP試劑盒        
FI8717
12 / 24 次
植物ChainFreeTM mCherry-tag RIP試劑盒         
FI871812 / 24 次


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18927549347、13430303037



RIP試劑盒簡介


RNA免疫共沉淀(RIP)是采用特異性抗體來調取內源性RNA結合蛋白及其結合RNA的技術。分離出的蛋白可以進行調取效果,而提取純化的RNA可以利用qPCR(RIP-qPCR)或利用高通量測序(RIP-Seq)方法來檢測。

根據樣本類型、誘餌蛋白是否攜帶標簽,以及beads類型不同,輝駿生物公司開發了多款RIP試劑盒,可用于分離不同生物樣本提取物中的目標蛋白及其結合RNA。

誘餌蛋白不帶標簽時,可以根據beads的不同選擇protein G 或Protein A/G RIP試劑盒,當誘餌蛋白攜帶標簽時,可以根據標簽種類的不同選擇ChainFreeTM 系列試劑盒,該系列試劑盒采用了優化并重組表達的、無輕重鏈的標簽抗體磁珠進行RIP實驗。IP復合物無論采用非變性洗脫還是變性洗脫,均不會出現抗體的輕、重鏈污染問題。




RIP試劑盒應用


RNA結合蛋白(RBPs)是可以與RNA結合的蛋白質,參與調控了RNA的眾多生物學過程。可以說,沒有RBPs,RNA幾乎寸步難行。RIP技術主要應用于驗證或尋找與已知RBP結合的RNA。以下列舉了可應用RIP試劑盒的幾個研究方向:

1. RBPs功能研究,如活性調控、定位等;

2. RBPs調控的RNA功能研究,如合成、可變剪切、修飾、轉運、定位、穩定性和翻譯等。





Protein G和ProteinA/G RIP試劑盒-輝駿生物產品優勢


1、特殊優化的beads與抗體親和效率高,抗體用量少;

2、裂解效率高:優化的各裂解液體系分別適用于動物、植物或微生物樣本;

3、操作簡便,周期短,適合初學者。

4、品質好,實驗結果穩定。

5、洗脫液適配后續qPCR和高通量測序實驗。
RIP試劑盒(rna免疫共沉淀試劑盒)-輝駿生物-價格低大量現貨.png


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