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服務介紹應用案例常見問答

 LC-MS/MS蛋白鑒定 * 技術原理


質譜是將待測物質變為氣態離子并將離子按質荷比(m/z)進行分離和分析的一種方法。蛋白先經胰蛋白酶消化成肽段,肽段在質譜儀中離子化后,會帶上一定量的電荷,通過檢測器分析,可得到各肽段的質荷比(m/z),即一級質譜圖;為獲得肽段更詳細的序列信息,部分肽段再次被破碎和分析,產生二級質譜圖。最后采用質譜檢索軟件選擇相應的蛋白數據庫,對獲得的全部質譜數據進行分析,同時以打分的形式將鑒定到的蛋白依次排列,得到樣本中蛋白的定性結果。




LC-MS/MS蛋白鑒定 * 實驗流程



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LC-MS/MS蛋白鑒定 * 應用范圍


可以檢測各種類型的蛋白樣本,例如蛋白溶液、干粉、膠條或斑點等,一次上機可以檢測到高達1000多種蛋白質。以下列舉了可能應用液質聯用質譜(LC-MS/MS)的幾個方向:

1.  IP,Co-IP,Pull-down類蛋白相互作用樣本(膠條或溶液)的鑒定;

2. 細胞器,外泌體等簡單樣本的蛋白質表達譜鑒定(全譜分析)


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LC-MS/MS蛋白鑒定 * 服務信息


項目名稱

客戶提供

結果交付

實驗周期

價格

LC-MS/MS蛋白鑒定

蛋白溶液(干冰運輸)

蛋白膠條/膠點(冰袋運輸)

廣州地區可上門取樣

樣本信息表

蛋白及肽段鑒定結果表

質譜檢索網頁

指定肽段的質譜圖

質譜原始數據

實驗報告

2周







LC-MS/MS蛋白鑒定 * 服務優勢



輝駿生物旨在為客戶提供良好的質譜鑒定服務,客戶可以進行幾乎所有感興趣的研究,如蛋白質組分析、小分子的高分辨率分析、復雜環境中小分子的定量分析等。

1
近十年服務經驗,眾多服務案例,服務成果得到優秀期刊認可
2
自有互作實驗平臺,對IP、pull down等微量蛋白的鑒定有十足把控力
3
可以提供實驗設計、樣品制備、質量控制、質譜處理、生物信息學和統計分析等全套服務內容
4
質譜儀器先進,操作人員技術成熟,鑒定準確度和靈敏度高
5

售后技術支持將一直保持到客戶發表文章,確保客戶安心進行下游實驗及投稿





LC-MS/MS蛋白鑒定 * 客戶文獻


1. UBAP2L arginine methylation by PRMT1 modulates stress granule assembly. Cell Death Differ. (2020 , IF=10.717).

2. Gao C.J. et al: The plant ESCRT component FREE1 shuttles to the nucleus to attenuate abscisic acid signaling. Nature Plants, 5(5):512-524 (2019,IF=19.40).

3. Tang W.W. et al: The p300/YY1/miR-500a-5p/HDAC2 signalling axis regulates cell proliferation in human colorectal cancer. Nature Communications (2019,IF = 12.121).

4. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods, 15(3): 213–220 (2018,IF=28.467).




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輝駿實力

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中文標題:捕獲新轉錄RNA的相互作用體,或促進對不同細胞和系統中總RNA結合蛋白質組的深入研究

發表期刊:Nature Methods

影響因子:28.467

合作單位:中國科學院廣州生物醫學與健康研究所

運用技術:LC-MS/MS蛋白質譜鑒定(由輝駿生物提供技術支持)



● 研究背景


目前系統研究RNA結合蛋白質組的方法主要是基于捕獲多聚腺苷酸(PolyA)RNA,主要是帶有寡聚(DT)包被珠的mRNA。然而PolyA尾巴只在新轉錄的RNA成熟的過程中被添加到RNA中,而一些成熟的mRNA要么是非PolyA的,要么是雙態的。此外,成熟的非PolyA RNA物種占所有轉錄序列的很大一部分。捕獲與所有類型RNA相互作用的RNA結合蛋白的方法不僅可以擴大我們目前對RNA相互作用組的看法,而且有助于理解非Polya RNA在生理和疾病中的功能。




● 研究結果


1. 利用RICK技術捕獲新轉錄的RNA互作組


研究者用Eu標記HeLa細胞中的RNA,固定細胞后通過點擊反應使Eu生物素化,然后用鏈霉親和素包裹的珠子提取RNA-蛋白質復合物。凝膠電泳和銀染證實Rick方法成功分離出與EU標記RNA直接相互作用的蛋白質。Western blotting驗證了Rick對已知RNA相關蛋白的捕獲。

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  圖1



2. Rick捕獲的RNA種類


研究者對Rick pull down樣本進行了RNA測序(RNA-seq),分析結果(圖2A)與Castello的oligo(DT)捕獲數據相比顯示出明顯的差異,在該數據中,捕獲的RNA中80%是mRNA。接下來,研究者研究了Rick樣本中的富集與三種相關的非PolyA RNA:CircRNA、近端啟動子RNA(ppRNA)和增強子RNA(ERNA)的oligo(Dt)捕獲情況。在對ppRNA的評估中,與oligo(Dt)捕獲相比,Rick樣本中轉錄暫停基因(TR>4)在TSS周圍積累了更高的RNA-seq信號,這表明僅通過Rick就能有效地分離ppRNA;而非暫停基因(TR<4)差異則很小(圖2B,C)。此外,在Rick樣本中,RNA-seq信號在假定的增強子區域16(6.05%)上有很強的富集,而在寡核苷酸(DT)捕獲中幾乎沒有(0.11%)(圖2D)。RT-qPCR進一步證實,與oligo(Dt)捕獲相比,用Rick提取的非Polya RNA分離效果良好。簡言之,除Polya RNA外,Rick還成功地分離出了其他各種RNA種類,表明它也可以富集不是通過寡核苷酸(DT)捕獲方法分離的相關結合蛋白。

LC-MS/MS蛋白質譜鑒定-客戶文獻-輝駿生物.png

圖2



3. RICK法分離蛋白質的特性研究


采用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)對Rick分離的蛋白質進行分析。與oligo(DT)捕獲在不同條件下的比較表明,Rick分離了許多在oligo(DT)捕獲研究中沒有鑒定到的蛋白質)(圖3B),這些差異既不是由于細胞培養、蛋白質組學程序的差異,也不是由Eu標記引起的(圖3A)。


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圖3

 


4. RICK分離蛋白的功能分析


對295個RICK特有的RBP進行了GO分析,觀察了與有絲分裂相關的生物過程的富集(圖4A)。KEGG途徑分析還將“細胞周期”列為前十個最顯著富集的途徑(圖4B)。相反,對Rick鑒定的425種蛋白質進行的GO和KEGG分析顯示,oligo(dT)捕獲數據集中存在的蛋白質主要與RNA相關。綜上所述,這些數據進一步加強了Rick在分離用寡核苷酸(DT)捕獲方法未鑒定出的蛋白質方面的獨特性,并揭示了RNA在意想不到的細胞過程中的功能。

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圖4


 

5. RICK識別與非polyA RNA優先結合的蛋白質


考慮到通過Rick和oligo(DT)捕獲分離的RNA種類的顯著差異,295個RICK特有的RBP中有相當一部分可能優先與非polyA RNA結合。這種特異性可能是由于化學計量學、亞細胞定位或潛在的內在結合特異性。LC-MS/MS鑒定出914個高置信度蛋白質,稱之為“PolyA缺失型Rick蛋白”。在這914個蛋白質中,576個與標準Rick程序的720個高置信度蛋白質重疊(圖5A)。進一步分析表明,295個RICK特有的RBP中有204個(69.2%)與914個PolyA缺失型Rick蛋白重疊(圖5B)。此外,在710個與RICK特有RBP不重疊的710個polyA缺失型RICK蛋白中,有563個出現在oligo(DT)捕獲數據集中(圖5B),這表明這些蛋白具有結合PolyA和非PolyA RNA的混合趨勢。這些結果表明,Rick可用于鑒定優先與非Polya RNA結合的蛋白質。


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圖5

 


6. 與METTL1和CDK1相互作用的RNA特性 


我們選擇了兩個Rick特有的RBP METTL1和CDK1,用PAR-CLIP測序方法研究了它們相互作用的RNA。METTL1的兩個獨立PAR-CLIP測序實驗顯示捕獲的RNA存在廣泛重疊,其中很大一部分也被RICK捕獲。進一步分析證實METTL1與tRNA顯著結合,還與多種推測為非polyA的RNA結合,如內含子RNA和從基因間區域轉錄的RNA(圖5C)。接下來,研究者使用隨機六聚體或寡聚體(dT)引物進行RNA免疫沉淀(RIP),然后進行RT-qPCR,以識別METTL1靶RNA是否具有polyA尾巴。RIP-qPCR顯示,使用隨機六聚體富集了7個mRNA,而使用寡聚(DT)引物只能擴增出其中的3個,證實了METTL1與含有mRNA序列的非PolyA RNA結合(圖5D)。CDK1 PAR-CLIP測序分析顯示與轉錄自基因間區域和內含子RNA的RNA結合,與RICK捕獲的RNA也存在廣泛重疊。后續分析進一步表明,METTL1和CDK1廣泛地與非PolyA RNA結合,暗示這兩種蛋白的RNA相關功能被忽視。

 



7. 利用RICK捕獲新生RNA互作組


研究者對HeLa細胞進行了短Eu標記(0.5、1和2小時),以研究Rick是否可以捕獲與新生RNA互作的蛋白。鑒定了208種不同的高置信度蛋白質(分別為149、119和143,作用時間分別為0.5、1和2小時),稱之為“新生富集RBP”和319種低置信度蛋白質(圖6A)。對208個新生富集RBP進行的GO和KEGG通路分析顯示,轉錄和RNA代謝相關術語顯著豐富(圖6B)。進一步的研究表明,新生RNA轉錄和局部代謝物產生之間存在聯系,從而調節表觀基因和潛在的表觀轉錄基因。

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圖6

 


8. 利用RICK獲取mESC總RNA互作組


為證明Rick可以應用于其他類型的細胞,研究者用鏈霉親和素結合辣根過氧化物酶證實了Eu在mESC中的有效摻入,并進行了LC-MS/MS,鑒定出518個高置信蛋白和304個低置信蛋白。這518個高置信度蛋白質中有160個與Kwon等人報告的“mESC mRNA相互作用組”重疊,而358個是RICK獨有的,因此將其稱為RICK獨有的mESC RBP。對這358個候選限制性商業慣例的GO分析顯示,RNA結合或PolyA RNA結合術語豐富。在這358個蛋白中,有95個在mESC中的表達水平高于分化后的細胞,這表明mESC在自我更新或多能性方面具有潛在的作用。因此,Rick可以應用于HeLa以外的不同細胞類型;此外還需要進一步的研究來確定新發現的候選RBP在mESC自我更新/多能性中的作用。


輝駿生物實驗外包服務商,10年專注科研實驗,專業提供全方位等科研服務。輝駿自有蛋白質組學平臺,對蛋白的質譜鑒定有十足的把控能力,對后續的生物信息分析有獨到的見解。


目前,我們已為上千位客戶在Nature、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功發表IF>10的高分文獻(點擊查看客戶文獻),歡迎各位咨詢lc-ms/ms檢測實驗,實驗電話:4006991663

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Q1:蛋白質譜鑒定不成功一般有哪些因素?

A:質譜鑒定不成功主要可以分為兩類,一類是質譜效果不好,一類是沒有可參考的蛋白數據庫,質譜效果不好的原因又可以細分為蛋白點太淡以至于蛋白含量過低(常見銀染的點)、蛋白酶解及質譜操作失誤等,要避免這些因素要盡量取顏色深一些的蛋白點,并且取的蛋白點面積需要適當大一些。


Q2:做蛋白鑒定檢索時為什么同一個編號對應了很多蛋白質?

A:因為一個蛋白家族中常常含有多個同源性很高的蛋白質,這些蛋白質被酶切之后,很可能會產生很多相同的肽段,軟件在進行定性分析時,就會將這些肽段均歸于得分高的那種蛋白質,其他同源蛋白不計分,并且這些同源蛋白都采用同一編號。


Q3:怎么判定哪些蛋白是和自己研究相關的蛋白,挑選什么樣的蛋白進行后期實驗驗證

A:需要研究人員根據自己研究的相關生物學背景,再結合生物信息學分析的結果,以及查看相關的文獻資料來確認哪些蛋白可以用于后續深入的研究。后期的蛋白驗證實驗,一般情況下是根據客戶的需要,結合課題本身,在所篩選到的差異的蛋白中,找到自己關注的蛋白。并且在挑選的時候盡量挑蛋白可信度高的、差異變化較明顯的蛋白。目前驗證實驗的成功率比較低,一般情況下能有50%的概率已經是非常好的結果。


Q4:蛋白質鑒定結果較少的可能原因是什么?

A:●根據樣品SDS-PAGE圖(注:SDS-PAGE無過度染色情況),判斷樣本本身的蛋白質豐富程度,蛋白質條帶較少或者較淺(含量低)都會導致鑒定結果不佳,可考慮增加樣本量再進行檢測。

●根據SDS-PAGE圖判斷樣品中是否存在高豐度蛋白質,高豐度蛋白質會影響樣本整體蛋白質鑒定數量。

●有些物種的數據庫質量不好,包含的蛋白數目過少,這種可以考慮換大一級的物種分類數據庫,或者選擇在進化樹上同源性較近的、研究比較清楚的、基因組數據庫相對完整的模式物種的數據庫重新查庫。

●樣本中有污染或干擾物質,例如常見的有PEG、各種表面活性劑(如SDS、CHAPS、Triton、Tweens、NP-40等),一般在質譜的表現為規律的分子量間隔約44的峰。

●輝駿生物會根據TIC、basepeak圖等,判斷酶解、儀器狀態等是否正常,如果是儀器問題導致的鑒定結果不好,我方會即刻告知客戶并安排重復實驗。


Q5:LC-MS/MS實驗能否提供蛋白質定量信息或確定樣品中不同蛋白質的相對含量?

A:我們通常說的質譜鑒定(LC-MS/MS實驗)為定性實驗,不能做定量分析,但如果您要比較某樣本中不同蛋白質的相對含量,可參考蛋白質質譜鑒定結果中的emPAI值(據譜圖數、肽段數或肽段得分等來獲得的近似定量信息)來大概評估每個蛋白的豐度情況,但這只是粗略估計。

如果您要比較蛋白在多組樣本間的相對表達差異,請選擇蛋白組組學的方法檢測,如label freeiTRAQTMTDIA等,并且通常需要設置樣本重復,以便進行統計學分析。


Q6:為什么質譜檢測到的蛋白質只是部分氨基酸序列,這樣的數據是否可信?

A:質譜鑒定需要先進行蛋白質的酶解,酶解后的肽段再進行質譜分析。蛋白質酶解成肽段的回收率不能達到100%,一定會發生肽段的損失;如果是膠內酶解肽段的回收率會更低一些。

由于蛋白質多種修飾形式的存在,會導致部分序列酶解不完全;或者由于蛋白質的序列特點(酶切位點過于稀疏或者密集),導致酶切后的肽段過小或者過大,都不利于質譜檢測。

 根據質譜檢測原理,肽段需要被離子化后才能被檢測到。由于肽段序列特點,導致某些不容易被離子化的片段很難被檢測到。

因此,質譜法鑒定蛋白質的結果一般都只是鑒定到蛋白質的部分序列,即可以達到定性蛋白質的目的。


Q7:質譜結果鑒定到很多蛋白,如何評估蛋白的可信度,或者如果篩選蛋白進行后續研究?

A:輝駿生物提供的鑒定表格中包括了原始蛋白列表和過濾后的蛋白列表,其中過濾后的蛋白列表中為篩選(pep_expect<0.05)后的蛋白,均為可信蛋白。所有蛋白按照得分排序,得分越高的蛋白可信度越高。但要注意,如果您做的是IP,pull down類實驗,有意義的蛋白可能由于本身豐度較低而得分低、排名靠后,針對這種情況我們建議您主要依據蛋白功能判斷,其次參考得分。


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