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服務介紹應用案例常見問答
Label free非標定量蛋白質組學實驗原理


Label-free是一種非標記的定量蛋白質組學技術,不需使用同位素標簽做內部標準,直接根據肽段質譜峰的強度對蛋白進行相對定量。

不同樣本提取的蛋白質進行定量,取等量蛋白分別進行胰酶酶解,之后純化的各組肽段分別做LC-MS/MS分析;采用特定軟件檢索原始質譜數據,解析出不同樣本中各個肽段的定量信息,進而獲得蛋白質在不同樣本中的定性和定量信息




Label free實驗技術流程


 

label free蛋白_label free技術服務價格_label free蛋白組學檢測.jpg





label free蛋白質組學技術應用



1、蛋白鑒定和定量;
2、差異蛋白的篩選和鑒定。

 




label-free蛋白組學實驗檢測—輝駿服務優勢


1

近十年服務經驗,眾多服務案例,服務成果得到優秀期刊認可

2

對蛋白篩選與定量方面有獨到見解,擅長針對客戶情況提出合適的方案建議


3

自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執行最優的實驗路線


4

售后技術支持將一直保持到客戶發表文章,確保客戶安心進行下游實驗及投稿





非標定量蛋白質組學label free技術服務信息



項目名稱

客戶提供

結果交付

實驗周期

價格

Label free

原始樣本(干冰運輸,廣州地區可上門取樣)

樣本信息表

分析要求
       

1、蛋白鑒定及定量結果表
2、肽段鑒定及定量結果表

3、差異蛋白結果表
4、生物信息學分析結果
5、質譜原始數據
6、實驗報告

3-4




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18927549347






Label Free蛋白質組學實驗—客戶文獻



1.Hervé V. et al:Large-Scale Proteomics of the Cassava Storage Root and Identification of a Target Gene to Reduce Postharvest Deterioration. The Plant Cell.2014,IF=9.618.
【研究內容】:木薯是熱帶地區最重要的塊根作物,但木薯采后生理快速退化(PPD)是制約木薯商品化生產的主要原因。研究者建立了一種基于圖像的PPD癥狀量化方法,并使用Label Free非標記定量蛋白質組學方法,在木薯根中鑒定出2600多個獨特的蛋白質,其中近300個蛋白質在PPD過程中表現出顯著的豐度調節。基于蛋白質組學數據、酶活性和脂質過氧化檢測,最終確定谷胱甘肽過氧化物酶是降低PPD的候選藥物。
使用技術:label free定量蛋白組分析、Label-free實驗外包服務


2.Brian D.et al:Large-Scale Label-Free Comparative Proteomics Analysis of Polo-Like Kinase 1 Inhibition via the Small-Molecule Inhibitor BI 6727(Volasertib) in BRAF V600E Mutant Melanoma Cells. Journal of Proteome Research.2015,IF=4.074.
【研究內容】:Polo-like kinase1(Plk1)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在多種人類癌癥中過表達,對持續的致癌增殖至關重要。為了更好地了解Plk1信號轉導機制,研究者利用Label Free非標記定量蛋白質組學方法,發現Plk1特異性抑制劑BI 6727處理人黑色素瘤A375細胞后,多個蛋白的表達發生了變化。此外,研究者還通過異質核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)確定了Plk1和p53之間的新關聯,從而為Plk1在癌細胞存活中的作用提供了有價值的見解。
使用技術:label-free 質譜、Label free非標定量蛋白質組學、LabelFree定量實驗檢測



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輝駿實力

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中文標題:小分子抑制劑BI 6727對BRAFV600E突變黑色素瘤細胞Polo樣激酶1抑制作用的大規模非標記比較蛋白質組學分析

發表期刊:Journal of proteome research

影響因子:4.074

運用技術:Label Free非標定量蛋白質組學 (由輝駿生物提供技術支持)




● 內容概述


Polo-like kinase1(Plk1)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,通過調節有絲分裂的進入、進展和退出,在多種人類癌癥中過表達,對持續的致癌增殖至關重要。本研究通過利用定量蛋白質組學策略來比較Plk1特異性抑制劑BI 6727處理后BRAFV600E突變黑色素瘤細胞的蛋白質組,利用無標記納米LC?MS/MS技術在Q-Exactive上進行篩選,鑒定了20多個感興趣的蛋白;并通過乳酸和NAD水平來評估與細胞代謝相關的降低。此外,研究中還發現了多個蛋白酶體亞基的下調,導致20S蛋白酶體活性顯著降低。有關異質核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)的檢測也進一步確定了Plk1和p53之間的新關聯,從而為Plk1在癌細胞存活中的作用提供了有價值的見解。

 




● 研究路線


1
Label free非標記定量蛋白質組學分析BI 6727抑制PIk1后人黑色素瘤細胞蛋白質組的定量變化
2
Panther分析評估集體蛋白質的分子功能,確定催化活性和結合是主要的蛋白質功能
3
NAD、NADH和 NADPH檢測結果表明P1k1抑后NADH和NADPH水平顯著降低,NAD的下降幅度更大
4
20S蛋白酶體活性測定結果表明BI 6727治療導致多個20S蛋白酶體亞基下調
5
異質性核糖核蛋白C1/C2檢測結果表明P1k1通過調節 HNRNPC介導的p53表達





● 研究結果


1. BI 6727處理、蛋白質鑒定、定量和分析

 

為確定Plk1在黑色素瘤中的下游分子機制,研究者闡明了BI 6727抑制Plk1后人黑色素瘤細胞蛋白質組的定量變化。使用Label Free方法進行分析,為準確確定蛋白質比例,每種樣本類型設置了三個以上的實驗重復。該方法識別出1800多種蛋白質,其中343種被識別的蛋白質表現出顯著的表達變化。


接下來,研究者使用Panther(通過進化關系進行蛋白質分析)來評估集體蛋白質的分子功能,并確定催化活性和結合是主要的蛋白質功能(圖2C)。

 

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2. BI 6727治療改變多種代謝蛋白的表達


蛋白質組學分析結果表明,Plk1活性的抑制導致多種代謝蛋白的表達減少,包括蘋果酸脫氫酶1(MDH1)、谷草轉氨酶2(GOT2)和轉酮醇酶(TKT)。此外,Western blot結果證實了乳酸脫氫酶A(LDHA)、葡萄糖-6-磷酸異構酶(GPI)和乳酸脫氫酶B(LDHB)顯著降低(圖3A)。有趣的是,LDHA、LDHB和GPI均在糖酵解中扮演著重要的角色。推測Plk1的過表達可能有助于癌癥相關的從線粒體氧化磷酸化OXPHOS向有氧糖酵解的轉換。

 

為了評估Plk1抑制對有氧糖酵解的影響,研究者分別測量了細胞外乳酸的水平,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的水平,乳酸是葡萄糖分解的主要副產品,而NADH和NADPH是糖酵解和磷酸戊糖途徑分解葡萄糖過程中產生的酶輔助因子。結果顯示兩個治療組(25 NM和100 NM)的乳酸水平與對照組相比顯著降低(圖3C)。在BI-6727處理的細胞中,NADH和NADPH水平顯著降低,幾乎降低了5倍(圖3D)。這些數據表明,Plk1抑制后NAD+的下降幅度更大,鑒于丙酮酸到乳酸的轉化是NAD+再生的主要途徑,有理由預測LDHA的下降是比率變化的主要因素。

 

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3. BI 6727治療導致多個20S蛋白酶體亞基下調


 泛素-蛋白酶體系統通過一個系統過程對細胞內80%~90%的蛋白質降解起著不可或缺的作用。在比較蛋白質組學分析中,研究者發現BI6727治療導致人黑色素瘤細胞中多個20S亞基的顯著下調。進一步擴大IPA分析范圍,發現20S亞基α7和β6分別下調了2.46%和5.56%(圖4B)。使用熒光團標記的蛋白酶體底物檢測了20S蛋白酶體的活性,檢測顯示,與對照組相比,BI 6727處理細胞的20S活性顯著降低(圖4D)。

 

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4. 異質性核糖核蛋白C1/C2在BI 6727治療后上調

 

異質性核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)是一種普遍存在的RNA結合蛋白,主要以hnRNPC1和hnRNPC2兩種異構體表達。最近的一項研究表明,HNRNPC過表達通過抑制有絲分裂蛋白極光激酶B(AurkB)在肝細胞癌(HCC)細胞中誘導微核。Plk1活性的抑制可能會對AurkB的表達產生負面影響,與Plk1抑制相關的有絲分裂可能部分通過HNRNPC和AurkB介導。此外,HNRNPC被證明通過直接與p53 mRNA 5‘編碼區的順式元件結合來促進p53的翻譯。研究者分別通過Western blot和p21的轉錄分析發現p53蛋白的表達和活性相應地增加(圖5E)。這些數據為Plk1通過調節HNRNPC介導的p53表達提供了令人信服的證據。

 

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● 結論


對BI 6727抑制人黑色素瘤A375細胞Plk1的蛋白質組學研究發現,多個蛋白的表達發生了變化,這些蛋白尚未被確定為Plk1信號網絡的一部分。蛋白質組學分析提供了Plk1和HNRNPC之間一種新的關系的證據,并且Plk1抑制對厭氧糖酵解和蛋白酶體活性有相當大的影響,這兩條途徑是癌細胞生存所必需的。這些數據為新的Plk1信號通路和未來靶向治療的潛在候選者提供了堅實的基礎。

Q:

Label Free有哪些技術特點?

A:

對液相色譜串聯質譜的穩定性和重復性要求較高;無需昂貴的同位素標簽作內部標準,實驗耗費低;對樣本的操作也最少,從而使其最接近原始狀態,并且不受樣品條件的限制,克服了標記定量技術在對多個樣本進行定量方面的缺陷。


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