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服務介紹應用案例常見問答
TMT蛋白質組學實驗技術原理



TMT(Tandem Mass Tags)是由美國Thermo公司研發的體外同重同位素標記的定量技術。該技術采用10-plex或16-plex標記試劑,可以同時比較10組或16組樣本之間的蛋白表達差異。TMT同位素試劑標記多肽氨基基團后,等量混勻多肽并進行LC-MS/MS分析。一級質譜中,不同樣品來源的同一肽段表現出相同的m/Z;二級質譜中,化學鍵斷裂釋放出報告離子,低質量區的報告離子強度反映了該肽段在不同樣品中的相對表達量,高質量區的肽段碎片離子m/Z反映了該肽段的序列信息。質譜原始數據經過數據庫檢索,即可得到樣本中所含蛋白及其表達差異。




TMT標記定量蛋白組學實驗技術流程



TMT標記定量蛋白質組學,TMT標記定量,TMT,TMT定量蛋白質組學





TMT蛋白組學應用領域


基礎醫學:疾病標志物,發病機制,疾病分型等;

生物醫藥:藥物機理,藥效評價,藥物開發等;

農林畜漁:抗逆脅迫,生長發育,耐藥,致病機理等。




tmt蛋白組學技術服務—輝駿生物優勢


1

高通量: 16-plex TMT試劑盒可同時標記最多 16組樣本

2

適用范圍廣:幾乎可對任何物種的各類蛋白質進行分離鑒定,不受蛋白大小或酸堿性等因素影響


3

靈敏度高:低豐度蛋白也能檢出


4

定量準確:不同標記的肽段等量混合后上機,避免技術誤差,提高檢測效率



聯系技術支持
18927549347






tmt定量蛋白組學實驗服務信息



項目名稱

客戶提供

結果交付

實驗周期

價格

TMT

原始樣本(-80℃保存,干冰運輸)
樣本信息表
分析要求

       

 1、蛋白鑒定及定量結果表
 2、肽段鑒定及定量結果表
 3、差異蛋白結果表
 4、生物信息學分析結果
 5、質譜原始數據
 6、實驗報告

5-6周







TMT蛋白質組學實驗服務結果示例



生物信息學分析-輝駿生物


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TMT蛋白質組學實驗外包—客戶文獻



1. Li K. et al: Tyrosine kinase Fyn promotes osteoarthritis by activating the β-catenin pathway. Ann Rheum Dis, 0:1–9 (2018,IF=14.299).

2. Global iTRAQ-based proteomic profiling of Toxoplasma gondii oocysts during sporulation. J Proteomics.(2016 , IF=5.168).

3. Comparative Proteomics Analysis of Bacillus amyloliquefaciens SQR9 Revealed the Key Proteins Involved in in Situ Root Colonization. J Proteome Res.(2014 , IF=4.173).

4. Zeng L. et al: Asparagine Synthetase and Filamin A Have Different Roles in Ovarian Cancer. Front Oncol. (2019,IF=4.848).



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中文標題:酪氨酸激酶Fyn通過激活β-連環蛋白途徑促進骨關節炎

發表期刊:Ann Rheum dis

影響因子:14.299

發表時間:2018年

合作單位:南方醫科大

運用技術TMT標記定量蛋白質組學分析(由輝駿生物提供技術支持)




● 研究背景


骨關節炎(OA)是一種年齡相關性或創傷后退行性關節疾病,其確切的發病機制仍不明確。目前OA尚無有效的疾病修飾治療方法,迫切需要開發新的治療藥物。因此,了解控制軟骨細胞肥大和調控細胞外基質降解相關基因表達的機制對于開發有效的OA治療方法具有重要意義。




● 研究路線


1. 樣本分析證實Fyn在老年小鼠、創傷后骨性關節炎小鼠和人類骨性關節炎的關節軟骨中聚集


2. 基因敲除實驗表明Fyn基因缺失阻止小鼠創傷后和年齡相關骨性關節炎的發生


3. 蛋白質組學技術證實Fyn與軟骨細胞中的β- catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩定


4. 抑制劑治療顯示FYN抑制劑AZD0530和PP1抑β- catenin信號轉導并阻止小鼠骨性關節炎的發生




● 研究結果


1. Fyn在老年小鼠、創傷后骨性關節炎小鼠和人類骨性關節炎的關節軟骨中聚集


研究者首先選取年輕(2個月)和老年(12個月)小鼠的關節軟骨來識別與軟骨退化有關的蛋白質。其中酪氨酸激酶Fyn是老年軟骨中表達最強的蛋白(圖1A)。對4、13和24月齡小鼠的關節軟骨進行Western blotting分析,證實了老化軟骨中Fyn的顯著增加(圖1B),Fyn的積累伴隨著老年小鼠軟骨的退化和OARSI分級的增加(圖1C,D)。為了確定Fyn在人OA關節軟骨中的表達是否升高,研究者比較了接受過全膝關節置換術的老年OA患者(年齡67.00±3.03歲)軟骨和無關節炎病史的年輕交通事故患者(30.25±8.18歲)的正常軟骨中Fyn的表達。免疫熒光分析發現,老年組和OA組軟骨細胞中Fyn水平明顯升高,同時OA組軟骨結構發生變性和丟失(圖1E,F)。這些結果表明,Src激酶家族成員Fyn在老年小鼠和OA患者的退變和損傷的關節軟骨中聚集。

iTRAQ蛋白質組學分析、itraq實驗服務、iTRAQ技術

圖1



2. Fyn基因缺失阻止小鼠創傷后和衰老相關OA的發生 

  

為了確定Fyn在退變或受損軟骨的關節軟骨細胞中積聚的意義,研究者進行了Fyn基因敲除實驗。Western blotting分析顯示了8周齡小鼠軟骨中Fyn基因的缺失(圖2A,B)。與對照組相比,基因敲除組(Fyn-KO小鼠)關節軟骨或生長板的形態和組織均沒有明顯差異,這表明Fyn基因的缺失沒有引起小鼠骨骼發育異常。與對照組相比,Fyn-KO組小鼠的軟骨中的蛋白質含量顯著減少,TUNEL染色顯示Fyn-KO小鼠關節軟骨細胞凋亡明顯減少(圖2G),軟骨降解程度有所降低。這些結果表明,Fyn的缺失有效地阻止了小鼠創傷后和年齡依賴性OA的發展。

iTRAQ蛋白質組學分析、itraq實驗服務、iTRAQ技術

圖2



3. Fyn與軟骨細胞中的β-catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩定


為了探討Fyn促進OA發生的機制,研究者通過蛋白質組學的方法對軟骨前體細胞系ATDC5中與Fyn相互作用的蛋白進行了鑒定,在純化的復合物中發現β-catenin可能是FYN的潛在互作伙伴(圖3A)。IP分析證實β-catenin與Fyn在ATDC5細胞(圖3B)、原代軟骨細胞和軟骨組織中存在相互作用。β-catenin和Fyn的雙重染色也顯示β-catenin與Fyn在ATDC5細胞中共定位(圖3C)。為了確定Fyn是否磷酸化軟骨細胞中的β-catenin,研究者在ATDC5細胞中進行了體外Fyn激酶檢測。結果顯示,Fyn免疫沉淀使β-catenin在體外Tyr142處磷酸化,這種磷酸化被Fyn激酶抑制劑PP1或AZD0530抑制(圖3D)。此外,β-catenin及其磷酸化(Tyr142)的表達通過Fyn SiRNA被顯著下調(圖3E),但在ATDC5細胞中通過Fyn編碼質粒的Fyn過表達而增強(圖3F)。為了驗證Fyn在β-catenin信號通路中的關鍵作用,研究者在ATDC5細胞中檢測了鈣粘附素-catenin復合體的形成。PP1對Fyn的抑制或siRNA下調Fyn的表達可以穩定鈣粘連蛋白-連環蛋白復合體,而Fyn的過度表達則破壞了該復合體(圖3H)。這些數據表明,Fyn與β-catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩定,導致軟骨細胞中鈣粘連蛋白-catenin復合體的解離。

iTRAQ蛋白質組學分析、itraq實驗服務、iTRAQ技術

圖3



4. Fyn激活β-catenin途徑促進OA的發生


在Fyn和β-catenin的雙重染色中發現,隨著Fyn水平的增加,β-catenin從細胞膜轉移到了細胞核(圖4A)。用促炎因子白細胞介素1β(IL-1β)處理ATDC5細胞,誘導Fyn和β-catenin在細胞漿和細胞核中的積聚(圖4B),并增加Fyn的表達和磷酸化水平(Tyr416),β-catenin的表達和磷酸化水平(Tyr142),以及MMP13的表達(圖4C)。接下來,研究者評估了老年小鼠和創傷后OA小鼠軟骨中β-catenin及其磷酸化的水平。結果顯示,β-catenin及其磷酸化水平隨著年齡的增長和OA的加重而增加(圖4D)。此外,創傷后FYN-KO小鼠關節軟骨細胞中的β-catenin水平及其核定位明顯低于對照組(圖4F)。WNT3a是典型的Wnt/β-catenin途徑的激活劑。Fyn的敲除實驗顯示,在OA的發生發展過程中,Fyn激活了不依賴Wnt信號的β-catenin通路,并增強了β-catenin在關節軟骨細胞中的核轉位。關節注射icg-001明顯減少了軟骨損傷,維持了關節軟骨中蛋白多糖的含量,并降低了OA發生過程中的關節炎分級,退變軟骨中MMP13和ADAMTS5的表達水平也相應降低。這些結果表明,β-catenin通路參與了Fyn刺激軟骨細胞MMP13和ADAMTS5的表達以及小鼠OA的發生與發展。

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圖4



5. FYN抑制劑AZD0530和PP1抑制β-catenin信號轉導并阻止小鼠骨性關節炎的發生

   

為了研究Fyn作為OA治療靶點的潛在用途,研究者檢測了Fyn的化學抑制劑在OA的發病和進展中的作用。AZD0530和PP1是Src激酶(包括Fyn)的選擇性抑制劑,可用于癌癥的治療。注射小鼠后,與賦形劑治療的小鼠相比,AZD0530和PP1治療顯著減少了軟骨的破壞(圖5A)、OARSI分級(圖5B)和滑膜炎癥,MMP13、ADAMTS5和X膠原含量、TUNEL陽性軟骨細胞數和骨鈣素表達也顯著減少(圖5C,D)。這些結果表明,抑制Fyn激酶活性可以阻止小鼠創傷后骨性關節炎的發生。Western blotting顯示AZD0530或PP1可阻斷IL-1β刺激引起的MMP13和ADAMTS5的上調,并抑制p-β-catenin(Tyr142)的增加(圖5E)。接下來,研究者檢測了用或不用AZD0530或PP1AZD0530或PP1治療的創傷后OA小鼠的軟骨樣本中p-β-catenin(Tyr142)的表達。結果顯示,AZD0530和PP1處理的小鼠,MMP13、p-FYN和p-β-catenin(Tyr142)的表達均明顯降低(圖5F)。此外,用AZD0530或PP1治療OA時,Fyn和β-catenin在軟骨細胞核中的共存也被取消(圖5G)。這些結果表明,AZD0530和PP1通過抑制FYN誘導的磷酸化β-catenin的表達來預防OA的發生。

iTRAQ蛋白質組學分析、itraq實驗服務、iTRAQ技術

圖5

Q:

iTRAQ及TMT等標記定量蛋白質組技術有什么特點?

A:

iTRAQ以及TMT等標記定量蛋白質組技術分辨率高,細胞樣品最多可鑒定超過6000個蛋白,并且絕大多數蛋白都有定量和定性信息;其次是通量高,可以一次最多完成8個(iTRAQ)或者10個(TMT)樣品的實驗,特別適合于多組樣品間的同時比較以及生物學過程的動態檢測。


Q:

沒有全基因組數據的物種該如何進行蛋白的鑒定?

A:

對于已經公布全基因組序列的物種,可以在得到全序列后構建本地建庫并進行本地檢索;對于未進行全基因組測序的物種,可以采用近緣物種的數據庫或者EST數據以及轉錄組數據進行檢索。


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