當前位置:首頁 > 科研服務 > 蛋白組/代謝組 > 定量蛋白質組學 > iTRAQ標記定量
服務介紹應用案例常見問答

iTRAQ蛋白質組學 * 技術原理


iTRAQ(Isobaric tag for relative and absolute quantitation)是由美國AB SCIEX公司研發的體外同重同位素標記的定量技術。該技術采用8-plex標記試劑,可以同時比較8組樣本之間的蛋白表達差異。iTRAQ的8種同位素標記試劑由報告基團(113、114、115、116、117、118、119、121)和平衡基團(192、191、190、189 、188、187、186、184 )及肽反應基團組成。不同的報告基團分別與相應的平衡基團相配后,相對分子質量均為305,即等量異位標簽。iTRAQ同位素試劑標記多肽氨基基團后,等量混勻多肽并進行LC-MS/MS分析。一級質譜中,不同樣品來源的同一肽段表現出相同的質荷比;二級質譜中,化學鍵斷裂釋放出報告離子,低質量區的報告離子強度反映了該肽段在不同樣品中的相對表達量,高質量區的肽段碎片離子質荷比反映了該肽段的序列信息。質譜原始數據經過數據庫檢索,即可得到樣本中所含蛋白及其表達差異。




iTRAQ蛋白質組學 * 實驗流程


iTRAQ定量蛋白質組學-itraq實驗服務-itraq檢測平臺.jpg





iTRAQ蛋白質組學 * 技術應用


基礎醫學:疾病標志物,發病機制,疾病分型等;

生物醫藥:藥物機理,藥效評價,藥物開發等;

農林畜漁:抗逆脅迫,生長發育,耐藥,致病機理等。





iTRAQ蛋白質組學 * 輝駿服務優勢


1

十年服務經驗,客戶成果發表在NatureMethods,Oncogene,Cell Research等高水平期刊上。

2

對蛋白篩選與定量方面有獨到見解,擅長針對客戶情況提出合適的方案建議


3

自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執行最優的實驗路線。


4

售后技術支持將一直保持到客戶發表文章,確保客戶安心進行下游實驗及投稿



聯系技術支持 
18927549347



iTRAQ蛋白質組學 * 服務信息


項目名稱

客戶提供

結果交付

實驗周期

價格

iTRAQ

原始樣本(-80℃保存,干冰運輸)
樣本信息表
分析要求

 1、蛋白鑒定及定量結果表
 2、肽段鑒定及定量結果表
 3、差異蛋白結果表
 4、生物信息學分析結果
 5、質譜原始數據
 6、實驗報告

5-6周








iTRAQ蛋白質組學 * 分析結果示例




f0692e0be4f34577a44a93e517215acf_1635317693321945.jpg



聯系技術支持 
18927549347



iTRAQ蛋白質組學 * 客戶文獻


1. Li K. et al: Tyrosine kinase Fyn promotes osteoarthritis by activating the β-catenin pathway. Ann Rheum Dis. 2018,IF=14.299.
【研究內容】:骨關節炎和軟骨退變過程中,WNT/β-catenin被激活的機制尚未完全明確,本研究利用iTRAQ蛋白質組學技術,篩選了年輕(2月齡)和老齡(12月齡)小鼠的蛋白表達差異,并發現一種在老年軟骨中強烈上調的蛋白——酪氨酸激酶Fyn。為了探究Fyn促進骨關節炎發展的機制,客戶將免疫沉淀(IP)與蛋白質組學分析相結合,最終證明酪氨酸激酶Fyn可以通過激活β-catenin通路促進關節炎,為骨關節炎提供了一個新的治療靶點。
使用技術:iTRAQ蛋白質組學分析、iTraq實驗外包服務


2. Wu X.S. et al: Ubiquitin-specific protease 3 promotes cell migration and invasion by interacting with and deubiquitinating SUZ12 in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2019,IF= 7.068.
【研究內容】:泛素特異性蛋白酶3 (USP3) 的異常表達可能在腫瘤發展中起重要作用,然而其促進胃癌轉移的機制尚不明確。本研究利用itraq蛋白質組學技術鑒定了USP3過表達胃癌細胞與對照細胞之間差異表達的蛋白質,發現SUZ12對于USP3介導的胃癌活性是不可或缺的,USP3結合SUZ12,去泛素化SUZ12并使其穩定。SUZ12敲除抑制USP3誘導的遷移、侵襲和EMT。結果表明USP3-SUZ12信號通路促進胃癌發展。  
使用技術:itraq定量實驗、itraq定量蛋白組學檢測


3. Xiao Y.Y. et al: A comprehensive investigation of starch degradation process and identification of a transcriptional activator MabHLH6 during banana fruit ripening. Plant Biotechnol J. 2018,IF=6.84.
【研究內容】:本研究探討了淀粉水果“香蕉”在成熟過程中的淀粉降解機制。研究者基于iTRAQ的蛋白質組學實驗鑒定了18種與淀粉顆粒表面結合的淀粉降解相關酶,其中10種在成熟過程中顯著上調。酵母單雜交、電泳遷移率分析、ChIP等實驗進一步表明,香蕉果實成熟過程中的淀粉降解,可能歸因于轉錄和翻譯水平上與淀粉分解相關的許多酶的復雜作用,MabHLH6可能通過直接激活一系列淀粉降解相關基因而作為該過程的積極調節者。
使用技術:蛋白質組 iTRAQ、蛋白質組學itraq


4. Zeng L. et al: Asparagine Synthetase and Filamin A Have Different Roles in Ovarian Cancer. Front Oncol. 2019,IF=4.848.
【研究內容】:臨床上早期卵巢漿液性癌較難發現,而高級別漿液性癌(HGSC)和低級別漿液性癌(LGSC)的蛋白表達譜將為診斷和化療提供重要信息。研究者通過iTRAQ技術對13例HGSC和7例LGSC患者的標本進行了蛋白質組學分析,共鑒定出323個差異表達的蛋白質。IHC驗證后,選擇天冬酰胺合成酶(ASNS)和細絲蛋白A(FLNA)進行進一步的功能研究。體內和體外實驗結果表明,ASNS和FLNA是HGSC和LGSC的不同的生物標志物,可能對漿液性癌的預后和臨床治療有潛在的價值。
使用技術:itraq分析、itraq差異蛋白實驗





熱門推薦


蛋白組/代謝組實驗
? iTRAQ 定量蛋白質組學

? Label Free 實驗檢測服務itraq,label free,lc-ms/ms質譜鑒定,DIA實驗,廣泛靶向代謝組學

? LC-MS/MS 蛋白質譜鑒定

? DIA 全息掃描定量蛋白質
廣泛靶向代謝組學

蛋白/核酸相互作用實驗
? GST pull down

? RNA pull downRNA pulldown,DNA pulldown,GST pulldown.png

? DNA pull down

? Co-IP 免疫共沉淀

? TAP-MS串聯親和純化

分子細胞生物學實驗
? 基因調取/合成 (cDNA克隆)

? 熒光定量PCR (qPCR)分子細胞生物學實驗.jpg

? 載體構建實驗服務

? miRNA靶基因驗證
慢病毒包裝

科研產品
哺乳動物細胞表達載體慢病毒表達載體 慢病毒干擾載體 人cdna克隆庫.jpg

? 人cDNA克隆庫

? 慢病毒表達載體

? 慢病毒干擾載體

抗體工程服務
單克隆抗體測序抗體測序 抗體從頭測序 抗體表達.jpg

? 抗體從頭測序

? 抗體表達服務

? 重組抗體表達

實驗試劑盒
? RNA pull down 試劑盒RNA pulldown試劑盒 GST pulldown試劑盒 coip試劑盒 flag試劑盒 .jpg

? GST pull down 試劑盒

? COIP 試劑盒

? Flag 試劑盒





輝駿實力

輝駿實驗外包服務.jpg



4899+客戶已添加微信獲取實驗優惠!

封面.png

中文標題:酪氨酸激酶Fyn通過激活β-連環蛋白途徑促進骨關節炎

發表期刊:Ann Rheum dis

影響因子:14.299

發表時間:2018年

合作單位:南方醫科大

運用技術TMT標記定量蛋白質組學分析(由輝駿生物提供技術支持)




● 研究背景


骨關節炎(OA)是一種年齡相關性或創傷后退行性關節疾病,其確切的發病機制仍不明確。目前OA尚無有效的疾病修飾治療方法,迫切需要開發新的治療藥物。因此,了解控制軟骨細胞肥大和調控細胞外基質降解相關基因表達的機制對于開發有效的OA治療方法具有重要意義。




● 研究路線


1
2

樣本分析證實Fyn在老年小鼠、創傷后骨性關節炎小鼠和人類骨性關節炎的關節軟骨中聚集

基因敲除實驗表明Fyn基因缺失阻止小鼠創傷后和年齡相關骨性關節炎的發生

3
4

蛋白質組學技術證實Fyn與軟骨細胞中的β- catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩定

抑制劑治療顯示FYN抑制劑AZD0530和PP1抑β- catenin信號轉導并阻止小鼠骨性關節炎的發生





● 研究結果


1. Fyn在老年小鼠、創傷后骨性關節炎小鼠和人類骨性關節炎的關節軟骨中聚集


研究者首先選取年輕(2個月)和老年(12個月)小鼠的關節軟骨來識別與軟骨退化有關的蛋白質。其中酪氨酸激酶Fyn是老年軟骨中表達最強的蛋白(圖1A)。對4、13和24月齡小鼠的關節軟骨進行Western blotting分析,證實了老化軟骨中Fyn的顯著增加(圖1B),Fyn的積累伴隨著老年小鼠軟骨的退化和OARSI分級的增加(圖1C,D)。為了確定Fyn在人OA關節軟骨中的表達是否升高,研究者比較了接受過全膝關節置換術的老年OA患者(年齡67.00±3.03歲)軟骨和無關節炎病史的年輕交通事故患者(30.25±8.18歲)的正常軟骨中Fyn的表達。免疫熒光分析發現,老年組和OA組軟骨細胞中Fyn水平明顯升高,同時OA組軟骨結構發生變性和丟失(圖1E,F)。這些結果表明,Src激酶家族成員Fyn在老年小鼠和OA患者的退變和損傷的關節軟骨中聚集。

iTRAQ蛋白質組學分析、itraq實驗服務、iTRAQ技術

圖1



2. Fyn基因缺失阻止小鼠創傷后和衰老相關OA的發生 

  

為了確定Fyn在退變或受損軟骨的關節軟骨細胞中積聚的意義,研究者進行了Fyn基因敲除實驗。Western blotting分析顯示了8周齡小鼠軟骨中Fyn基因的缺失(圖2A,B)。與對照組相比,基因敲除組(Fyn-KO小鼠)關節軟骨或生長板的形態和組織均沒有明顯差異,這表明Fyn基因的缺失沒有引起小鼠骨骼發育異常。與對照組相比,Fyn-KO組小鼠的軟骨中的蛋白質含量顯著減少,TUNEL染色顯示Fyn-KO小鼠關節軟骨細胞凋亡明顯減少(圖2G),軟骨降解程度有所降低。這些結果表明,Fyn的缺失有效地阻止了小鼠創傷后和年齡依賴性OA的發展。

iTRAQ蛋白質組學分析、itraq實驗服務、iTRAQ技術

圖2



3. Fyn與軟骨細胞中的β-catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩定


為了探討Fyn促進OA發生的機制,研究者通過蛋白質組學的方法對軟骨前體細胞系ATDC5中與Fyn相互作用的蛋白進行了鑒定,在純化的復合物中發現β-catenin可能是FYN的潛在互作伙伴(圖3A)。IP分析證實β-catenin與Fyn在ATDC5細胞(圖3B)、原代軟骨細胞和軟骨組織中存在相互作用。β-catenin和Fyn的雙重染色也顯示β-catenin與Fyn在ATDC5細胞中共定位(圖3C)。為了確定Fyn是否磷酸化軟骨細胞中的β-catenin,研究者在ATDC5細胞中進行了體外Fyn激酶檢測。結果顯示,Fyn免疫沉淀使β-catenin在體外Tyr142處磷酸化,這種磷酸化被Fyn激酶抑制劑PP1或AZD0530抑制(圖3D)。此外,β-catenin及其磷酸化(Tyr142)的表達通過Fyn SiRNA被顯著下調(圖3E),但在ATDC5細胞中通過Fyn編碼質粒的Fyn過表達而增強(圖3F)。為了驗證Fyn在β-catenin信號通路中的關鍵作用,研究者在ATDC5細胞中檢測了鈣粘附素-catenin復合體的形成。PP1對Fyn的抑制或siRNA下調Fyn的表達可以穩定鈣粘連蛋白-連環蛋白復合體,而Fyn的過度表達則破壞了該復合體(圖3H)。這些數據表明,Fyn與β-catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩定,導致軟骨細胞中鈣粘連蛋白-catenin復合體的解離。

iTRAQ蛋白質組學分析、itraq實驗服務、iTRAQ技術

圖3



4. Fyn激活β-catenin途徑促進OA的發生


在Fyn和β-catenin的雙重染色中發現,隨著Fyn水平的增加,β-catenin從細胞膜轉移到了細胞核(圖4A)。用促炎因子白細胞介素1β(IL-1β)處理ATDC5細胞,誘導Fyn和β-catenin在細胞漿和細胞核中的積聚(圖4B),并增加Fyn的表達和磷酸化水平(Tyr416),β-catenin的表達和磷酸化水平(Tyr142),以及MMP13的表達(圖4C)。接下來,研究者評估了老年小鼠和創傷后OA小鼠軟骨中β-catenin及其磷酸化的水平。結果顯示,β-catenin及其磷酸化水平隨著年齡的增長和OA的加重而增加(圖4D)。此外,創傷后FYN-KO小鼠關節軟骨細胞中的β-catenin水平及其核定位明顯低于對照組(圖4F)。WNT3a是典型的Wnt/β-catenin途徑的激活劑。Fyn的敲除實驗顯示,在OA的發生發展過程中,Fyn激活了不依賴Wnt信號的β-catenin通路,并增強了β-catenin在關節軟骨細胞中的核轉位。關節注射icg-001明顯減少了軟骨損傷,維持了關節軟骨中蛋白多糖的含量,并降低了OA發生過程中的關節炎分級,退變軟骨中MMP13和ADAMTS5的表達水平也相應降低。這些結果表明,β-catenin通路參與了Fyn刺激軟骨細胞MMP13和ADAMTS5的表達以及小鼠OA的發生與發展。

iTRAQ蛋白質組學分析、itraq實驗服務、iTRAQ技術

圖4



5. FYN抑制劑AZD0530和PP1抑制β-catenin信號轉導并阻止小鼠骨性關節炎的發生

   

為了研究Fyn作為OA治療靶點的潛在用途,研究者檢測了Fyn的化學抑制劑在OA的發病和進展中的作用。AZD0530和PP1是Src激酶(包括Fyn)的選擇性抑制劑,可用于癌癥的治療。注射小鼠后,與賦形劑治療的小鼠相比,AZD0530和PP1治療顯著減少了軟骨的破壞(圖5A)、OARSI分級(圖5B)和滑膜炎癥,MMP13、ADAMTS5和X膠原含量、TUNEL陽性軟骨細胞數和骨鈣素表達也顯著減少(圖5C,D)。這些結果表明,抑制Fyn激酶活性可以阻止小鼠創傷后骨性關節炎的發生。Western blotting顯示AZD0530或PP1可阻斷IL-1β刺激引起的MMP13和ADAMTS5的上調,并抑制p-β-catenin(Tyr142)的增加(圖5E)。接下來,研究者檢測了用或不用AZD0530或PP1AZD0530或PP1治療的創傷后OA小鼠的軟骨樣本中p-β-catenin(Tyr142)的表達。結果顯示,AZD0530和PP1處理的小鼠,MMP13、p-FYN和p-β-catenin(Tyr142)的表達均明顯降低(圖5F)。此外,用AZD0530或PP1治療OA時,Fyn和β-catenin在軟骨細胞核中的共存也被取消(圖5G)。這些結果表明,AZD0530和PP1通過抑制FYN誘導的磷酸化β-catenin的表達來預防OA的發生。

iTRAQ蛋白質組學分析、itraq實驗服務、iTRAQ技術

圖5



Q:

iTRAQ及TMT等標記定量蛋白質組技術有什么特點?

A:

iTRAQ以及TMT等標記定量蛋白質組技術分辨率高,細胞樣品最多可鑒定超過6000個蛋白,并且絕大多數蛋白都有定量和定性信息;其次是通量高,可以一次最多完成8個(iTRAQ)或者10個(TMT)樣品的實驗,特別適合于多組樣品間的同時比較以及生物學過程的動態檢測。


Q:

沒有全基因組數據的物種該如何進行蛋白的鑒定?

A:

對于已經公布全基因組序列的物種,可以在得到全序列后構建本地建庫并進行本地檢索;對于未進行全基因組測序的物種,可以采用近緣物種的數據庫或者EST數據以及轉錄組數據進行檢索。



標簽:

上一篇:Western Blot

下一篇:暫無

你可能感興趣的實驗

電子郵箱

service@prodelecgroup.com

聯系電話

020-32053431 / 400-699-1663

聯系地址

廣州市黃埔區科學城廣州國際企業孵化器D506

微信咨詢

微信掃碼一對一咨詢

服務熱線
4006991663
返回頂部