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服務介紹

lncRNA與蛋白互作實驗概述


lncRNA (Long non-coding RNA)即長鏈非編碼RNA,通常長度在200-100000 nt,具有5’帽子和3’polyA尾巴結構。

近年來,越來越多的研究聚焦lncRNAs。lncRNA與蛋白質的結合是其重要的調控方式之一,通過與蛋白質的結合,lncRNA參與多種細胞過程。例如:

1

調控該結合蛋白的活性

2

改變該結合蛋白的細胞定位

3

與其他RNA/蛋白競爭結合某蛋白,來調控其他RNA或蛋白的活性

4

結合轉錄因子,調控基因轉錄活性

5

招募染色體重構和修飾復合體到特定位點,改變DNA/RNA的修飾狀態、染色體結構等




 

lncRNA與蛋白互作服務信息


lncRNA-蛋白互作研究按照實驗內容可分為兩大類,一是以感興趣的lncRNA為中心,尋找或驗證與該lncRNA結合的蛋白質;二是以感興趣的蛋白質為中心,尋找或驗證與該蛋白質結合的lncRNA。


lncRNA與蛋白互作技術服務
技術類型技術目標技術原理
價格
外源性RNA pull-down
體外條件下尋找或驗證與目標lncRNA結合的蛋白質

體外轉錄帶有生物素標記的lncRNA,并與樣本裂解液孵育,利用鏈霉親和素磁珠捕獲體外條件下結合的靶RNA-蛋白質復合物,采用Western Blot或質譜技術確定復合物中的蛋白質

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內源性RNA pull-down體內條件下尋找或驗證與目標lncRNA結合的蛋白質

將自主研發的特異性RNA標簽與目標lncRNA構建融合表達載體,轉染細胞使其融合表達,通過與特異性RNA標簽結合的親和介質,將RNA標簽-lncRNA與蛋白的復合體純化出來,采用Western Blot或質譜技術確定復合物中的蛋白質

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RIP體內條件下尋找或驗證與目標蛋白質結合的lncRNA

用誘餌蛋白抗體捕獲體內條件下的誘餌蛋白與RNA復合物,采用qPCR或高通量測序技術確定與誘餌蛋白結合的lncRNA

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lncRNA與蛋白互作實驗服務優勢*輝駿生物


1

十年服務經驗,客戶成果發表在Nature Methods,Oncogene,Cell Research等高水平期刊上。

2

對圍繞RNA結合蛋白開展的整體課題提供全方位指導,包括上下游實驗設計和結合蛋白的多方法驗證等

3

自有蛋白質組學平臺,對RNA pull down產物這類微量蛋白的質譜鑒定有十足的把控能力,對后續的生物信息分析有獨到的見解

4

售后技術支持將一直保持到客戶發表文章,確保客戶安心進行下游實驗及投稿






lncRNA與蛋白互作實驗研究案例—客戶文章解析


RNA pull down研究案例.png

lncRNA LAMP5-AS1通過調控DOT1L甲基轉移酶活性促進MLL白血病發展



研究背景


研究者們通過大量臨床樣本的檢測發現,一個長鏈非編碼RNA(LncRNA)“LAMP5-AS1”在混合系白血病(MLL)中高表達,因此進一步探索了LAMP5-AS1在MLL白血病發生發展中的作用。




研究路線

細胞和小鼠實驗確定高表達的LAMP5-AS1促進MLL白血病進展

RNA pull-down結合質譜鑒定技術首次發現了LAMP5-AS1的潛在結合蛋白—DOT1L(一種H3K79甲基轉移酶)
RIP qPCR實驗確定了LAMP5-AS1與DOT1L結合
截短型 RNA pull down實驗進一步明確了與LAMP5-AS1結合的DOT1L結構域
體外酶活實驗表明LAMP5-AS1與DOT1L的結合促進了DOT1L的甲基轉移酶活性
RNA干擾結合ChIP實驗表明LAMP5-AS1影響MLL融合蛋白核心靶基因的H3K79me2/3水平
臨床分析LAMP5-AS可作為MLL白血病不良預后的預測因子



研究結論


lncRNA LAMP5-AS1在MLL白血病細胞的自我更新過程和分化阻滯中起著重要的作用。LAMP5-AS1對維持DOT1L酶在MLL白血病中的高活性具有重要意義,可能成為治療MLL白血病的一個有價值的靶點。



客戶文獻


Wang W.T. et al: The lncRNA LAMP5-AS1 drives leukemia cell stemness by directly modulating DOT1L methyltransferase activity in MLL leukemia. Journal of Hematology & Oncology. 2020. (IF=17.38).






lncRNA與蛋白互作技術服務—客戶文章


1. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters.Cell Research.2015, IF=13.9.

【研究內容】:作者通過RNA pull-down、RIP-qPCR、CoIP等技術,證實了lincRNA-p21與HNRNPK結合,并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成復合物。該復合物甲基化了多能性基因的啟動子序列及相應組蛋白,并改變了它們的表達量,從而進一步影響體細胞重編程過程。

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2. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods,15(3): 213–220. 2018,IF=28.467.
【研究內容】:輝駿生物為作者單位之一,和客戶共同開發了一種全新的RNA pull down,并用質譜鑒定新生RNA結合蛋白的方法。該方法主要是用EU標記新生RNA,再用點擊反應-生物素-鏈霉親和素系統做RNA-pull down,然后質譜鑒定分離的新生RNA互作蛋白。用該rna pulldown方法,首次鑒定到重要周期蛋白CCK1為RNA結合蛋白。RIP-qPCR、CLIP-Seq等實驗進一步證實了CCK1為RBP蛋白,并發揮著重要的細胞。
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3. Wang W.T. et al: The lncRNA LAMP5-AS1 drives leukemia cell stemness by directly modulating DOT1L methyltransferase activity in MLL leukemia. Journal of Hematology & Oncology.2020,IF=11.059.
【研究內容】:研究顯示高表達的LncRNA LAMP5-AS1能降低MLL白血病患者5年生存率。利用RNA pull down配合蛋白質質譜鑒定技術,作者首次發現LAMP5-AS1和DOT1L蛋白可能形成復合物。DOT1L是表觀遺傳中非常重要的甲基化酶。作者通過RIP-qPCR進一步確定了MLL細胞存在該復合物,并通過截短型RNA pull down實驗進一步確定了DOT1L的結合序列。后續的ChIP-qPCR等實驗證實了該復合物能有效影響DOT1L對組蛋白H3K79的甲基化水平,從而影響細胞的增殖分化。
使用相關技術:lncRNA與蛋白互作服務


4. He S.W. et al: AR-induced long non-coding RNA LINC01503 facilitates proliferation and metastasis via the SFPQ-FOSL1 axis in nasopharyngeal carcinoma. Oncogene. 2020,IF=7.971.
【研究內容】:lncRNA LINC01503在鼻咽癌中高表達,并且促進了腫瘤的不良預后。作者在此探討了LINC01503的作用機理,先用RNA pull down和質譜鑒定,發現SEPQ蛋白可能和LINC01503結合。RIP-qPCR實驗確證了鼻炎癌中LINC01503募集了SEPQ基因。基于SFPQ-FOSL1軸在癌癥研究中的重要地位,作者后續的工作思路之一也是關注該信號軸,并設計了CHIP-qPCR等實驗做出證明。RNA pull down配合質譜鑒定,為此文研究提供了關鍵性的研究源頭。
使用相關技術lncRNA與蛋白互作技術




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