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免疫共沉淀(Co-IP)* 實驗原理


結合了抗體的磁珠或樹脂(Beads)與樣本裂解液孵育,通過”抗原-抗體“之間的免疫作用,誘餌蛋白被吸附在Beads上,與此同時,誘餌蛋白的互作蛋白,也一起“共沉淀”到Beads上。洗滌去掉未結合的蛋白后,再用洗脫緩沖液將互作蛋白復合物從Beads上洗脫下來,得到免疫共沉淀(Co-IP)產物。Co-IP產物既可以用Western Blot檢測已知蛋白,也可以用質譜鑒定未知蛋白。


當沒有合適的誘餌蛋白抗體時,還可以通過表達融合了Flag標簽的誘餌蛋白,利用Flag標簽抗體做免疫沉淀。即樣本過表達Flag-Bait,經裂解后與anti-Flag珠子孵育,誘餌融合蛋白與Beads結合,其互作蛋白“共沉淀”到Beads上,再經洗滌、洗脫后,用WB或質譜檢測。


輝駿生物10年科研服務經驗,專業提供分子互作實驗服務,包括蛋白與蛋白、蛋白與DNA、蛋白與RNA、RNA與RNA的相互作用技術,經驗豐富,實驗結果穩定、可靠。

我公司自有分子、細胞和質譜實驗平臺,能執行最優的實驗路線,對微量互作蛋白的質譜鑒定有充足把控力,對后續功能分析有獨到見解。

我們不僅會提供專業的售前方案建議、而且售后技術支持將一直保持到文章發表,確保您安心進行下游實驗及投稿

目前,客戶已在Nature子刊、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功發表大量高分文章(點擊查看客戶文獻)




免疫共沉淀(Co-IP)* 實驗流程


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內源蛋白抗體免疫共沉淀CoIP實驗步驟



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標簽抗體免疫共沉淀CoIP實驗流程



免疫共沉淀(Co-IP)* 應用背景


蛋白質之間相互作用是其發揮生物學功能的主要模式,蛋白質會通過結合不同的伙伴來行駛不同的功能,形成復雜的信號轉導網絡。常見的蛋白互作研究方法主要有:免疫共沉淀(Co-IP)、pull down、酵母雙雜交、熒光雙分子互補(BiFC)、熒光共定位等。這些方法相互補充,通過多種方法共同驗證蛋白質間的相互作用,能更大程度的避免假陽性結果。


1
免疫共沉淀Co-IP

Co-IP技術采用抗體捕獲樣本中的目標蛋白及其互作蛋白復合物,反應的是體內真實的生理結合,但不能顯示這些相互作用是直接還是間接的;另外合適的免疫共沉淀抗體是決定實驗成功的關鍵,有些蛋白沒有合適的IP抗體,無法進行內源性Co-IP實驗;通過構建帶標簽的表達載體,使目標蛋白與標簽融合表達,再借助標簽抗體即可完成Co-IP實驗,但需要注意合適的轉基因方法又是影響該方法成功的關鍵。


2
pull down

pull down技術將目標蛋白進行體外原核表達,使標簽蛋白(GST或His等)與目標蛋白融合表達,借助標簽的親和介質將目標蛋白純化出來,可以不受抗體、物種限制,比較輕松的獲得目標蛋白的結合蛋白,還可以通過外源同時表達目標蛋白和待測蛋白,確定它們是否發生直接的相互作用,但該方法無法得知體內真實的結合情況。


3
酵母雙雜交

酵母雙雜交技術是比較古老的一種技術,將目標蛋白和待測蛋白與GAL4 的兩個結構域BD和AD融合表達,在酵母細胞中,2個蛋白的結合使得BD和AD在空間上靠近,從而激活報告基因lacZ的表達。但是由于受試蛋白都需要和 AD/BD 結構域形成融合蛋白,空間構象可能改變;另外假陽性率也比較高。


4
熒光雙分子互補(BiFC)

熒光雙分子互補(BiFC)技術將目標蛋白和待測蛋白分別與GFP的兩個片段融合表達,轉染細胞后,2個蛋白的結合使得GFP兩個片段空間上靠近,從而發出綠色熒光,該技術觀測直觀,操作簡便,但空間分辨率大約 250nm,對于蛋白質相互作用來說依然是個相當遠的距離,因此位置上靠近但并未結合的蛋白也可能顯示陽性結果,假陽性率較高;另外該技術可以驗證蛋白間的相互作用,但不能篩選未知互作蛋白。


5
熒光共定位

熒光共定位技術依靠熒光確定蛋白質具有相同定位,用于輔助證明而非直接證明細胞內蛋白間的相互作用。


技術支持聯系
18927549347、13430303037



免疫共沉淀Co-IP * 輝駿服務內容


服務項目
服務內容結果交付實驗周期客戶提供
價格

Co-IP WB

(驗證型)

樣本質檢

Western blot檢測誘餌蛋白和待測蛋白)

樣本的誘餌蛋白Western blot檢測圖

樣本的待測蛋白Western blot檢測圖

3-4周

實驗樣本

誘餌蛋白的IP級抗體

待測蛋白抗體

實驗信息表



Co-IP調取誘餌蛋白及其互作蛋白

(2組:實驗組、對照組)

IP產物的誘餌蛋白Western blot檢測圖

IP產物的待測蛋白Western blot檢測圖

CoIP實驗報告

Co-IP MS

(篩選型)

樣本質檢(Western blot檢測誘餌蛋白)樣本的誘餌蛋白Western blot檢測圖6-7周

實驗樣本

誘餌蛋白的IP級抗體

實驗信息表





Co-IP調取誘餌蛋白及其互作蛋白

(2組:實驗組、對照組)

IP產物的誘餌蛋白Western blot檢測圖

CoIP實驗服務報告

IP產物的質譜檢測及數據分析

質譜(LC-MS/MS)檢測結果及報

互作蛋白篩選表格

生物信息學分析結果和報告




免疫共沉淀CoIP * 樣本要求


樣本類型

CoIP 建議送樣量

CoIP 建議送樣量

動物細胞3*10e7個細胞/組(約3個10cm皿)5*10e7個細胞/組(約5個10cm皿)
動物組織1g/組2g/組
植物葉片2g/組4g/組
植物根或果實4g/組
8g/組
菌體50ul菌體沉淀/組100ul菌體沉淀/組

▲注意:這里列出的均為每組樣本的送樣量,如果實驗和對照組用的樣本一致,此樣本量*2。詳細送樣指南可聯系輝駿生物客服或銷售索取。

 保存及運輸:-80℃保存,干冰取樣/運輸,至少在送樣前2天通知我司。



免疫共沉淀Co-IP * 結果示例


免疫共沉淀CoIP實驗技術服務結果圖

Co-IP WB:誘餌蛋白和待測蛋白Western blot檢測圖(陽性)


免疫共沉淀Coip實驗服務結果圖分析

Co-IP MS:誘餌蛋白Western blot檢測圖


Co-IP試驗外包代做結果圖分析

Co-IP MS:質譜檢索表格(部分展示)



pull down生信分析結果.jpg

Co-IP MS:互作蛋白生信分析結果(部分展示)


技術支持聯系
18927549347、13430303037



免疫共沉淀(Co-IP)服務案例—客戶文章解析



Jiang S.Y. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP.

 Cancer Research. 2019. (中科院1區,IF=13.312).


膽固醇通過APMAP抑制EGFR降解誘導前列腺癌細胞轉移



研究概述

轉移性前列腺癌具有很高的致命性。已有報道表明,膽固醇與前列腺癌的發展有關;前期研究發現,膽固醇可以誘導前列腺癌細胞發生上皮-間質轉化(EMT),但其作用及潛在機制尚不清楚。本研究證明膽固醇介導APMAP上調,APMAP通過與EGFR競爭結合EPS15R,進而抑制EGFR降解,激活ERK1/2通路,促進前列腺癌細胞EMT;提出APMAP可能是一種關鍵的調節劑,為高脂肪飲食、肥胖和癌癥轉移之間提供了聯系。


11111.jpg



研究路線

細胞功能實驗證實膽醇誘導前列腺癌細胞EMT的發生依賴于ERK1/2的激活
RNA-seq、蛋白組學等實驗篩選和驗證與膽固醇有關的差異基因和蛋白,確定ERK1/2的上游凋節因子“ APMAI和“"EGFR”作為后續研究目標
APMAP基因敵除后的RNA-seq結果及其細胞實驗均顯示APMAP和膽固醇可能有相似的功能
APMAP和EGFR的表達關系實驗表明 APMAP通過調節EGFR參與膽固醇誘導的EMT過程
免疫共沉淀Co-IP結合質譜實驗找到 APMAP的互作蛋白EPS15R
免疫熒光結果顯示膽固醇誘導使EPS15R和APMAP的作用增強,EPS15R與EGFR解離,進而抑制EGFR降解
臨床樣本分析APMAP與前列腺癌的關系




免疫共沉淀(Co-IP) * 客戶文章


1. Li H.B. et al: The plant ESCRT component FREE1 shuttles to the nucleus to attenuate abscisic acid signaling. Nature Plants. 2019,IF=17.352.
【研究內容】:客戶發現,作為內體蛋白分選轉運復合體成分之一的FREE1基因,受到脫落酸刺激時候會發生磷酸化并移位到細胞核。客戶利用酵母雙雜交技術找到兩個核蛋白ABF4 and ABI5會與FREE1結合,免疫共沉淀CoIP實驗進一步證實了FREE與這兩個蛋白的互作。后續實驗表明,FREE1通過抑制ABF4、ABI5對下游基因的調控能力,參與了脫落酸信號通路。
使用相關技術:質譜鑒定、免疫共沉淀co-ip、Co-IP MS實驗


2. Jiang, S. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP. Cancer Research.2019,IF= 13.312.
【研究內容】:客戶利用蛋白質組學技術,篩選出膽固醇致前列腺癌發生上皮間質轉變(EMT)的重要基因APMAP和EGFR。通過在前列腺癌細胞表達3*Flag-APMAP基因,并利用免疫共沉淀CoIP及質譜鑒定技術,客戶發現EPS15R可與APMAP結合。進一步的研究證實,體內EPS15R-APMAP復合物通過EGFR致使細胞發生EMT。
使用相關技術:蛋白質組學、質譜鑒定、免疫共沉淀CoIP


3. Huang C.Y. et al: UBAP2L arginine methylation by PRMT1 modulates stress granule assembly. Cell Death Differ. 2020 , IF=12.067.
【研究內容】:前期研究表明UBAP2L蛋白參與應激顆粒形成。客戶在這項研究中,用免疫共沉淀結合質譜等技術,發現PRMT1甲基化UBAP2L,UBAP2L蛋白并且和另外三個應激顆粒形成有關的重要蛋白有相互作用。這些蛋白復合物介導了應激顆粒的形成。
使用相關技術:coip技術服務、質譜鑒定、修飾位點鑒定



免疫共沉淀(CoIP)* 輝駿服務優勢


1
近十年服務經驗,服務客戶眾多,案例發表在Nature Cell Biology、Nature Plants、Cancer Research等知名期刊上
2
對蛋白互作的篩選鑒定理解深刻,擅長針對客戶具體情況提出合適的方案建議
3
自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執行最優的實驗路線
4
自有蛋白質組學平臺,對微量CoIP實驗產物的質譜鑒定有十足的把控能力,對后續的生物信息分析有獨到的見解
5
售后技術支持將一直保持到客戶發表文章,確保客戶安心免疫共沉淀下游實驗及投稿





輝駿實力

輝駿生物提供的Co-IP免疫共沉淀服務分為以下兩種:


1. Co-IP WB,用于檢測某樣本中的誘餌蛋白和待測蛋白是否存在相互作用;

2. Co-IP MS,用于篩選某樣本中的誘餌蛋白與哪些蛋白具有相互作用。


Co-IP(免疫共沉淀)檢測服務
服務項目
服務內容結果交付實驗周期客戶提供
價格
Co-IP WBWestern blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白和待測蛋白
Western blot檢測圖3-4周

1、實驗樣本

2、誘餌蛋白的IP級抗體

3、待測蛋白抗體

4、實驗信息表(樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白和待測蛋白序列)



Co-IP調取誘餌蛋白及其互作蛋白

(2組:實驗組、對照組)
CoIP實驗報告
Western blot檢測Co-IP產物中的誘餌蛋白和待測蛋白Western blot檢測圖
Co-IP MS
Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖5-6周

1、實驗樣本

2、誘餌蛋白的IP級抗體

3、實驗信息表(樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白序列)





Co-IP調取誘餌蛋白及其互作蛋白

(2組:實驗組、對照組)
CoIP實驗服務報告
Western blot檢測Co-IP產物中的誘餌蛋白Western blot檢測圖
LC-MS/MS定性檢測Co-IP產物的蛋白、篩選實驗組獨有蛋白(潛在互作蛋白)質譜檢索表格、互作蛋白篩選表格、檢測報告
針對互作蛋白做生物信息學分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息學分析結果和報告
1周


加技術專員微信了解Co-IP實驗服務排期、優惠等
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CoIP實驗技術服務樣本要求


1. 送樣量要求


樣本類型
Co-IP WB建議送樣量Co-IP MS建議送樣量
動物細胞3*10e7個細胞/組(約3個10cm皿)5*10e7個細胞/組(約5個10cm皿)
動物組織1g/組2g/組
植物葉片2g/組4g/組
植物根或果實4g/組8g/組
菌體50ul菌體沉淀/組100ul菌體沉淀/組


▲注意:這里列出的均為每組樣本的送樣量,如果實驗和對照組用的樣本一致,此樣本量*2。詳細送樣指南可聯系輝駿生物客服或銷售索取。



2. 樣本保存和運輸要求:

(1)樣本用PBS清洗干凈后,離心去掉液體,先放入液氮中速凍,再轉移至-80℃冰箱中保存;

(2)樣本一定要做好標記,應用油性防凍記號筆或標簽紙在管上注明樣本名稱或編號;

(3)樣本較多或需要分批做,要將樣本分裝;

(4)干冰取樣/運輸;需要至少在送樣前一天通知我方。




免疫共沉淀coip實驗結果圖例


免疫共沉淀CoIP實驗技術服務結果圖

Co-IP WB:誘餌蛋白和待測蛋白Western blot檢測圖(陽性)


免疫共沉淀Coip實驗服務結果圖分析

Co-IP MS:誘餌蛋白Western blot檢測圖


Co-IP試驗外包代做結果圖分析

Co-IP MS:質譜檢索表格(部分展示)





Co-IP(免疫共沉淀)實驗服務客戶文章


1. Li H.B. et al: The plant ESCRT component FREE1 shuttles to the nucleus to attenuate abscisic acid signaling. Nature Plants. 2019,IF=17.352.
【研究內容】:客戶發現,作為內體蛋白分選轉運復合體成分之一的FREE1基因,受到脫落酸刺激時候會發生磷酸化并移位到細胞核。客戶利用酵母雙雜交技術找到兩個核蛋白ABF4 and ABI5會與FREE1結合,免疫共沉淀CoIP實驗進一步證實了FREE與這兩個蛋白的互作。后續實驗表明,FREE1通過抑制ABF4、ABI5對下游基因的調控能力,參與了脫落酸信號通路。
使用相關技術:質譜鑒定、免疫共沉淀CoIP、Co-IP MS實驗


2. Jiang, S. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP. Cancer Research.2019,IF= 13.312.
【研究內容】:客戶利用蛋白質組學技術,篩選出膽固醇致前列腺癌發生上皮間質轉變(EMT)的重要基因APMAP和EGFR。通過在前列腺癌細胞表達3*Flag-APMAP基因,并利用免疫共沉淀CoIP及質譜鑒定技術,客戶發現EPS15R可與APMAP結合。進一步的研究證實,體內EPS15R-APMAP復合物通過EGFR致使細胞發生EMT。
使用相關技術:蛋白質組學、質譜鑒定、免疫共沉淀CoIP


3. Huang C.Y. et al: UBAP2L arginine methylation by PRMT1 modulates stress granule assembly. Cell Death Differ. 2020 , IF=12.067.
【研究內容】:前期研究表明UBAP2L蛋白參與應激顆粒形成。客戶在這項研究中,用免疫共沉淀結合質譜等技術,發現PRMT1甲基化UBAP2L,UBAP2L蛋白并且和另外三個應激顆粒形成有關的重要蛋白有相互作用。這些蛋白復合物介導了應激顆粒的形成。
使用相關技術:CoIP技術服務、質譜鑒定、修飾位點鑒定



4899+客戶已添加微信獲取實驗優惠!

 免疫共沉淀(Co-IP)試劑盒


 名稱 貨號 規格
 貨
價格
 動物Co-IP試劑盒(protein A/G磁珠) FI8802 20次/40次 現貨


 動物Co-IP試劑盒(protein G樹脂) FI8803 20次/40次 現貨

 植物Co-IP試劑盒(protein A/G磁珠)

 FI8812 20次/40次 現貨
 植物Co-IP試劑盒(protein G樹脂) FI8813
 20次/40次 現貨


添加微信領取coip試劑盒說明書
18927549347、13430303037




免疫共沉淀試劑盒(Co-IP試劑盒)簡介


輝駿生物的免疫共沉淀試劑盒能夠高效完成抗原的免疫沉淀(IP)及免疫共沉淀(Co-IP)實驗。首先,將特異性的抗體加入樣品中與目標抗原形成免疫復合物,然后將其結合在protein G或protein A/G beads上。通過漂洗去除未結合物質后,用低 pH 的洗脫液將免疫復合物從beads上洗脫下來。洗脫的蛋白產物既可以用Western blot檢測已知蛋白,也可以用質譜(LC-MS/MS)鑒定未知蛋白。





免疫共沉淀CoIP試劑盒應用


蛋白-蛋白間的相互作用是蛋白質發揮生物學功能的主要模式。CO-IP試劑盒采用Protein G或Protein A/G beads來捕獲目標蛋白抗體,進而捕獲樣本中天然結合的目標蛋白及其互作蛋白。以下列舉了可應用CO-IP試劑盒的幾個研究方向:

1. 病毒、細菌等病原體侵染宿主細胞的機制;

2. 酶和底物的作用機制;

3. 天然狀態下蛋白調控復合體的研究。




CoIP免疫共沉淀試劑盒組分


 試劑名稱
 體積(20 Tests)
 體積(40 Tests) 保存條件
 Protein G beads或Protein A/G beads   
 850 μL 1.7 mL 4 ℃
 裂解緩沖液 11 mL 22 mL 4 ℃
 漂洗液 40 mL 80 mL 4 ℃
 洗脫緩沖液 1.1 mL 2.2 mL 4 ℃
 蛋白酶抑制劑 300 μL 600 μL -20 ℃




Co-IP免疫共沉淀試劑盒優勢

   

1、特異性強:親和材料經過特殊優化,與誘餌蛋白結合力更強,調取的互作蛋白更多。


2、裂解效率高:不同優化的裂解液配方分別適用于動物、植物樣本。

3、洗脫液適配后續Western Blot質譜(LC-MS/MS)實驗。

4、操作簡便,耗時短,適用于初學者。

5、應用靈活:可用于任何內源性目標蛋白的免疫沉淀或免疫共沉淀實驗。


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免疫共沉淀Co-IP試劑盒使用流程簡述


1. 將細胞裂解液與所選抗體在室溫下孵育 1-2 小時,或 4 ℃ 過夜。

2. 在室溫下,將抗原/抗體復合物與protein G或ProteinA/G beads結合 1-2 小時。

3. 漂洗、洗脫得到目標蛋白及其互作蛋白復合物。




CoIP試劑盒-客戶文獻


1. Jiang, S. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP. Cancer Research. 2019. IF= 13.312.

2. Huang C.Y. et al: UBAP2L arginine methylation by PRMT1 modulates stress granule assembly. Cell Death Differ. 2020. IF=12.067. 

3. Li T. et al: Phosphorylated ATF1 at Thr184 promotes metastasis and regulates MMP2 expression in gastric cancer. J Transl Med. 2022. IF=8.44.



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