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實驗簡介買此服務

SILAC-IP * 實驗原理


用SILAC結合免疫共沉淀(CoIP)尋找相互作用蛋白是SILAC在定量蛋白質組學研究基礎上的進一步應用,稱之為SILAC-IP技術。該技術通過質譜鑒定和分析蛋白質相對量來判斷是否是特異性結合誘餌蛋白,當實驗組與對照組中某個蛋白質量含量達到統計學的差異時,就判定這個蛋白質與誘餌蛋白質具有相互作用。SILAC技術是先將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素,即重鏈、輕鏈氨基酸蛋白。復合物分離后,混在同一管中做酶切質譜等。這樣既能鑒定到復合物蛋白,又能根據同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量,從而更準確地判斷出互作蛋白。





SILAC-IP * 實驗方案



不同的實驗背景和目的需對應用不同方案,輝駿生物提供以下三種SILAC-IP實驗方案:



方案一:以野生型細胞株為實驗材料


1.分別用輕、重鏈氨基酸培養細胞,取等量標記好的細胞提取蛋白質;
2.提取的輕鏈、重鏈細胞總蛋白分別用Normal IgG和抗bait蛋白的特異抗體做Co-IP;
3.混合輕、重鏈Co-IP產物;
4.胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。


SILAC免疫共沉淀技術服務_SILAC-IP_silac ip實驗外包公司.jpg


方案二:以過表達誘餌蛋白的細胞株為實驗材料


1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養正常對照細胞和過表達誘餌蛋白的細胞株(帶標簽),取等量標記好的細胞分別提取蛋白質,并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用誘餌蛋白抗體做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

SILAC IP代做_silac ip外包平臺.jpg



方案三:以干擾誘餌蛋白的細胞株為實驗材料


1. 分別用輕鏈、重鏈氨基酸培養RNAi 誘餌蛋白的細胞株和正常對照細胞株,取等量標記好的細胞分別提取蛋白質,并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用誘餌蛋白抗體做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

SILAC-IP外包實驗,silac ip技術服務,silac ip檢測實驗.jpg



SILAC-IP * 應用背景


免疫共沉淀(Co-IP)在分離純化蛋白復合物過程中,不可避免地會出現非特異結合蛋白,這些蛋白會一并被質譜鑒定出來,成為假陽性的互作蛋白,影響后續挑選驗證。 傳統的判斷假陽性互作蛋白方法是:用誘餌蛋白組鑒定到的蛋白列表,扣除掉對照組鑒定到的蛋白列表,作為“互作蛋白”。但很多真實的互作蛋白,比如豐度比較高的蛋白,在對照組中也會出現,而傳統的方法就會被排除掉。SILAC-IP技術將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素,結合質譜分析,既能鑒定到復合物蛋白,又能根據同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量,從而更準確地判斷出互作蛋白。

相較于傳統的免疫共沉淀和pull down技術,SILAC-IP技術特異性強,假陽性極低,通量高,靈敏度高,能直接檢測出與bait蛋白互作的其他蛋白的相對含量;適合于可傳代細胞,尤其是易轉基因細胞。


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18927549347



SILAC-IP * 輝駿服務內容


SILAC-IP(SILAC標記的免疫共沉淀)檢測服務
服務項目服務內容結果交付實驗周期客戶提供價格
SILAC-IPCo-IP預實驗input和CoIP產物的Western blot檢測圖
2-3周

未標記的待測細胞

SILAC標記完全的待測細胞

誘餌蛋白的IP級抗體

實驗信息表(樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白序列)





 


SILAC標記效率檢測

標記效率檢測表

標記效率檢測報告

2-3周
Western blot檢測SILAC標記細胞(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖7-8周
CoIP實驗調取誘餌蛋白及其互作蛋白

Western blot檢測圖

CoIP實驗報告

IP產物的SILAC蛋白定量檢測和分析

質譜檢索表

互作蛋白篩選表

互作蛋白生物信息學分析結果

SILAC檢測和分析報告





SILAC-IP * 結果示例



圖片.png

silac ip:質譜檢索表格(部分展示)




SILAC-IP  * 客戶文獻


1. Chen Y.J. et al: Identification of Novel SCIRR69-Interacting Proteins During ER Stress Using SILAC-Immunoprecipitation Quantitative Proteomics Approach. Neuromolecular Med. 2017,IF=2.629.

【研究內容】:為了更好地研究CREB/ATF家族成員SCIRR69在ER應激過程中的功能作用,研究者首先用ER應激激活劑(TG)和衣霉素(TM)處理了SCN和PC12細胞,,qRT-PCR和western結果顯示SCIRR69可能在ER應激中起重要作用。采用SILAC IP方法篩選出ER過程中SCIRR69的相互作用蛋白TERA和SFXN1,并通過Co-IP技術驗證了它們與SCIRR69的相互作用。研究結果有助于更好地理解SCIRR69在ER應激中的基本功能。

使用相關技術:silac ip檢測、silac ip服務、SILAC IP免疫共沉淀實驗服務


2. Edward. E. et al Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics. Journal of Visualized Experiments.  2014,IF=1.163.

【研究內容】:每個骨髓瘤患者都有多個亞克隆,具有高或低染色體不穩定性(CIN)特征的多個亞克隆共存會導致異質性和耐藥性,導致疾病復發。作者通過串聯親和純化質譜(TAP-MS)技術,發現了CIN基因NEK2與脫泛素酶USP7結合。該結合阻止了NEK2泛素化并使其穩定。研究發現,使用NEK2或USP7抑制劑進行靶向治療可能是骨髓瘤最有效的輔助治療方法。

使用相關技術:silac ip技術、silac ip免疫共沉淀、SILAC-IP質譜





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SILAC-IP(SILAC標記的免疫共沉淀)服務介紹


SILAC-IP是在SILAC標記細胞中進行Co-IP(免疫共沉淀)的技術。


SILAC-IP(SILAC標記的免疫共沉淀)檢測服務
服務項目服務內容結果交付實驗周期客戶提供價格
SILAC-IPCo-IP預實驗確定抗體拉取效果input和CoIP產物Western blot檢測圖
2-3周

待測細胞及其培養方法

誘餌蛋白的IP級抗體

實驗信息表(樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白序列)





 


Western blot檢測SILAC標記細胞(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖7-8周
CoIP實驗調取誘餌蛋白及其互作蛋白

Western blot檢測圖

SILAC蛋白定量檢測Co-IP產物的蛋白、篩選誘餌蛋白的互作蛋白

質譜檢索表

互作蛋白篩選表格

SILAC-IP實驗報告

針對互作蛋白做生物信息學分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息學分析結果和報告1周


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SILAC IP實驗服務*輝駿優勢

1

近十年服務經驗,眾多服務案例,服務成果得到優秀期刊認可。

2

對蛋白互作的篩選鑒定理解深刻,擅長針對客戶情況提出合適的方案建議

3

自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執行最優的實驗路線

4

自有蛋白質組學平臺,對微量互作蛋白的質譜鑒定有十足的把控能力,對后續的生物信息分析有獨到的見解

5

售后技術支持將一直保持到客戶發表文章,確保客戶安心進行下游實驗及投稿。





SILAC標記的免疫共沉淀實驗樣本要求


1. 送樣要求

樣本類型
建議送樣量
待測細胞

(廣州市內客戶)可接受活細胞,2個T25瓶,細胞匯合度>80%;

(其他地區客戶)凍存細胞2管。


2. 樣本保存和運輸要求:

(1)活細胞常溫取樣;

(2)凍存細胞干冰取樣/運輸:需要至少在送樣前一天通知我方。





silac-ip技術服務結果示例


圖片.png

silac ip:質譜檢索表格(部分展示)





免疫共沉淀SILAC-IP 客戶文獻


1. Chen Y.J. et al: Identification of Novel SCIRR69-Interacting Proteins During ER Stress Using SILAC-Immunoprecipitation Quantitative Proteomics Approach. Neuromolecular Med. 2017,IF=2.629.

【研究內容】:為了更好地研究CREB/ATF家族成員SCIRR69在ER應激過程中的功能作用,研究者首先用ER應激激活劑(TG)和衣霉素(TM)處理了SCN和PC12細胞,,qRT-PCR和western結果顯示SCIRR69可能在ER應激中起重要作用。采用SILAC IP方法篩選出ER過程中SCIRR69的相互作用蛋白TERA和SFXN1,并通過Co-IP技術驗證了它們與SCIRR69的相互作用。研究結果有助于更好地理解SCIRR69在ER應激中的基本功能。

使用相關技術:silac ip檢測、silac ip服務、SILAC IP免疫共沉淀實驗服務


2. Edward. E. et al Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics. Journal of Visualized Experiments.  2014,IF=1.163.

【研究內容】:每個骨髓瘤患者都有多個亞克隆,具有高或低染色體不穩定性(CIN)特征的多個亞克隆共存會導致異質性和耐藥性,導致疾病復發。作者通過串聯親和純化質譜(TAP-MS)技術,發現了CIN基因NEK2與脫泛素酶USP7結合。該結合阻止了NEK2泛素化并使其穩定。研究發現,使用NEK2或USP7抑制劑進行靶向治療可能是骨髓瘤最有效的輔助治療方法。

使用相關技術:silac ip技術、silac ip免疫共沉淀、SILAC-IP質譜



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