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串聯親和純化質譜TAP-MS * 實驗介紹


串聯親和純化質譜(TAP MS)技術采用兩輪純化的方法調取誘餌蛋白及其互作蛋白復合體。首先,在目的細胞中過表達帶有TST-Flag雙標簽的誘餌蛋白;樣本經裂解后,先與Streptactin樹脂孵育、初次洗滌及洗脫,得到首次純化的蛋白復合物;再將此蛋白復合物與anti-Flag樹脂結合、再次洗滌及洗脫,得到第二輪純化的蛋白復合物;最后,質譜鑒定復合物中的誘餌蛋白互作蛋白。



輝駿生物10年科研服務經驗,專業提供分子互作實驗服務,包括蛋白與蛋白、蛋白與DNA、蛋白與RNA、RNA與RNA的相互作用技術,經驗豐富,實驗結果穩定、可靠。

我公司自有分子、細胞和質譜實驗平臺,能執行最優的實驗路線,對微量互作蛋白的質譜鑒定有充足把控力,對后續功能分析有獨到見解。

我們不僅會提供專業的售前方案建議、而且售后技術支持將一直保持到文章發表,確保您安心進行下游實驗及投稿

目前,客戶已在Nature子刊、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功發表大量高分文章(點擊查看客戶文獻)




串聯親和純化質譜TAP-MS * 實驗流程


代做串聯親和純化-質譜,tap ms實驗.jpg




串聯親和純化質譜TAP MS * 應用背景


隨著確定細胞內蛋白質的相互作用成為當今生命科學的研究熱點,雙雜交技術已經廣泛應用于研究蛋白—蛋白間的相互作用,但由于其篩選步驟復雜,假陽性結果較多,難于量化,故不能滿足大規模蛋白質研究的需要,因此串聯親和純化(TAP)技術以其高效、高純度、以及能夠高度模擬真實生理條件等優勢,迅速成為篩選、發現和鑒別新的相互作用蛋白質的主流技術之一。

目前,TAP技術與質譜技術的聯用,以及質譜技術的自動化,使得大規模地分析相互作用的蛋白質在技術上成為可能。

TAP技術采用兩步親和純化,提高了純化產物的特異性,具有周期短、假陽性結果少等優點。通過這種方法鑒定到的蛋白質相互作用能真實地反映出細胞中蛋白質分子之間的聯系,實驗結果更加接近真實情況,而且TAP技術還特別適用于蛋白質組水平上的大規模研究。


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串聯親和純化質譜TAP MS * 輝駿服務內容


TAP(串聯親和純化)檢測服務
服務項目服務內容結果交付實驗周期客戶提價格
TAP MS構建誘餌蛋白的TAP雙標簽表達載體
載體質粒、甘油菌、測序結果和實驗報告約2周

含有誘餌基因序列的質粒模板及測序文件

待測細胞及其培養方法

實驗信息表(樣本信息、誘餌蛋白序列)





包裝慢病毒并進行誘餌蛋白的穩定表達細胞株篩選慢病毒包裝和穩轉株實驗報告5-6周
Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖7-8周

TAP調取誘餌蛋白及其互作蛋白

(2組:實驗組、空載對照組)
TAP實驗報告
Western blot檢測TAP產物中的誘餌蛋白Western blot檢測圖
LC-MS/MS定性檢測TAP產物的蛋白、篩選實驗組獨有蛋白(潛在互作蛋白)質譜檢索表格、互作蛋白篩選表格、檢測報告
針對互作蛋白做生物信息學分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息學分析結果和報告1周





串聯親和純化TAP MS * 結果示例

圖片.png

TAP MS:Western blot檢測圖



圖片.png

TAP MS:質譜檢索表格(部分展示)



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TAP-MS實驗研究案例—客戶文章解析


Hadir Marei. et al: Differential Rac1 signalling by guanine nucleotideexchange factors implicates FLII in regulating Rac1-driven cell migration.

Nat Communications. 2016,IF=14.919.


鳥嘌呤核苷酸交換因子的差異rac1信號涉及FLII在調節rac1驅動的細胞遷移中的作用


研究概述

 

小的GTP酶 rac1與腫瘤的形成和擴散有關。當被鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)激活時,rac1與細胞中的各種蛋白質結合,從而調節各種功能,包括細胞遷移。然而,當在臨床環境中以rac1為靶點時,rac1的激活可以導致相反的遷移表型,增加了加劇腫瘤進展的可能性。這就需要確定影響rac1驅動的細胞運動的因素。本研究證實P-Rex1不僅能激活rac1,而且還能將蛋白質(如FLII)定向到rac1的活性形式,以介導特定的細胞功能,包括細胞收縮,從而使P-Rex1能夠促進細胞遷移。因此,這項研究提供了對以前未報道的P-REx1-rac1介導細胞遷移的細胞功能的洞察力,并強調了P-Rex1和rac1可能驅動癌癥擴散其他模式。



研究路線

1

過表達與 pull down實驗證實Tiam1和P-Rex1誘導不同的rac1下游效應

2

通過TAP/ SILAC結合的方法檢測 Tiam1或 P-Rex1誘導后的rac1相互作用體,證實Tiam1和P-Rex1對racl互動體有不同的調控作用

3

免疫共沉淀、 GST pull down和PLA實驗結果證實FLII優先與活性racl結合FLII是一種新的富含P-RExl的rac1結合伙伴

4

結構域分析證實FLII通過不同的結構域與rac1和P-Rex1結合

5

Pull down實驗和細胞遷移實驗證實FLII是P-REx1-rac1驅動的細胞遷移所必需的

6

基因敲除實驗表明P-Rex1可以通過FLII介導特定的細胞功能,包括細胞收縮,從而促進細胞遷移




TAP MS * 客戶文章


1.  Li X.et al: Proteomic analyses reveal distinct chromatin-associated and soluble transcription factor complexes.Molecular Systems Biology.2015 ,  IF=8.991.

【研究內容】:轉錄因子(TF)是細胞信號通路的終極靶標和執行者。在這項研究中,作者對56個TF的可溶性和染色相關復合物進行了蛋白質組學分析,利用串聯親和純化和質譜(TAP/MS)技術進行純化,并鑒定其中的蛋白質-蛋白質相互作用。研究為大量的TF提供了有價值的蛋白質-蛋白質相互作用網絡資源,強調了TF形成不同位置特異性的蛋白質復合物的一般原理,這些復合物與TF的不同調控和不同功能有關。

使用技術TAP MS技術服務、串聯親和純化-質譜、串聯親和純化實驗怎么做




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輝駿生物提供的TAP(串聯親和純化)服務采用flag標簽和TST標簽進行串聯純化,用于篩選某樣本中的誘餌蛋白與哪些蛋白具有相互作用。


TAP(串聯親和純化)檢測服務
服務項目服務內容結果交付實驗周期客戶提價格
TAP MS構建誘餌蛋白的TAP雙標簽表達載體
載體質粒、甘油菌、測序結果和實驗報告約2周

1、含有誘餌基因序列的質粒模板及測序文件

2、待測細胞及其培養方法

3、實驗信息表(樣本信息、誘餌蛋白序列)





包裝慢病毒并進行誘餌蛋白的穩定表達細胞株篩選慢病毒包裝和穩轉株實驗報告5-6周
Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖7-8周

TAP調取誘餌蛋白及其互作蛋白

(2組:實驗組、空載對照組)
TAP實驗報告
Western blot檢測TAP產物中的誘餌蛋白Western blot檢測圖
LC-MS/MS定性檢測TAP產物的蛋白、篩選實驗組獨有蛋白(潛在互作蛋白)質譜檢索表格、互作蛋白篩選表格、檢測報告
針對互作蛋白做生物信息學分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息學分析結果和報告1周


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TAP串聯親和純化服務優勢*輝駿生物

1 近十年服務經驗,服務客戶眾多


2 對蛋白互作的篩選鑒定理解深刻,擅長針對客戶具體情況提出合適的方案建議


3自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執行最優的實驗路線


4 自有蛋白質組學平臺,對微量TAP實驗產物的質譜鑒定有十足的把控能力,對后續的生物信息分析有獨到的見解


5 售后技術支持將一直保持到客戶發表文章,確保客戶安心免疫共沉淀下游實驗及投稿




TAP-MS實驗樣本要求


1. 送樣量要求


樣本類型
TAP-MS建議送樣量
野生型細胞株

(廣州市內客戶)可接受活細胞,2個T25瓶,細胞匯合度>80%;

(其他地區客戶)凍存細胞2管。

穩轉細胞株1*10e8個細胞/組(約10個10cm皿),2組共計2*10e8個細胞


▲注意:如果客戶提供初始細胞株,需要同時提供詳細的細胞培養方法,廣州市內客戶可提供復蘇后的細胞,其他地區客戶請提供凍存細胞。

 


2. 樣本保存和運輸要求:

(1)如果客戶自行準備穩轉株,細胞沉淀用PBS清洗干凈后,離心去掉液體,先放入液氮中速凍,再轉移至-80℃冰箱中保存;

(2)樣本一定要做好標記,應用油性防凍記號筆或標簽紙在管上注明樣本名稱或編號;

(3)樣本較多或需要分批做,要將樣本分裝;

(4)干冰取樣/運輸;需要至少在送樣前一天通知我方。

 



串聯親和純化TAP技術實驗結果示例

圖片.png

TAP MS:Western blot檢測圖


圖片.png

TAP MS:質譜檢索表格(部分展示)





TAP MS客戶文章


1. Reinaldo F.M. et al: Destabilizing NEK2 overcomes resistance to proteasome inhibition in multiple myeloma. The Journal of Clinical Investigation.2020 , IF=11.864.

【研究內容】:每個骨髓瘤患者都有多個亞克隆,具有高或低染色體不穩定性(CIN)特征的多個亞克隆共存會導致異質性和耐藥性,導致疾病復發。作者通過串聯親和純化質譜(TAP-MS)技術,發現了CIN基因NEK2與脫泛素酶USP7結合。該結合阻止了NEK2泛素化并使其穩定。研究發現,使用NEK2或USP7抑制劑進行靶向治療可能是骨髓瘤最有效的輔助治療方法。

使用技術串聯親和純化質譜、TAP-MS實驗外包


2.  Li X.et al: Proteomic analyses reveal distinct chromatin-associated and soluble transcription factor complexes.Molecular Systems Biology.2015 ,  IF=8.991.

【研究內容】:轉錄因子(TF)是細胞信號通路的終極靶標和執行者。在這項研究中,作者對56個TF的可溶性和染色相關復合物進行了蛋白質組學分析,利用串聯親和純化和質譜(TAP/MS)技術進行純化,并鑒定其中的蛋白質-蛋白質相互作用。研究為大量的TF提供了有價值的蛋白質-蛋白質相互作用網絡資源,強調了TF形成不同位置特異性的蛋白質復合物的一般原理,這些復合物與TF的不同調控和不同功能有關。

使用技術TAP MS技術服務、串聯親和純化-質譜、串聯親和純化實驗怎么做




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