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GST pull down實驗原理


GST pull down技術是體外條件下研究蛋白質相互作用的方法。先將體外表達的GST融合蛋白結合到谷胱甘肽Beads上,再將靶蛋白-GST-Beads和細胞裂解液孵育,這樣互作蛋白便一起吸附在Beads上。洗滌掉未結合的蛋白后,再用洗脫液將互作蛋白復合物從Beads洗脫下來,即GST pull down產物。這種互作復合物既可以用Western Blot檢測已知蛋白,也可用質譜鑒定出未知蛋白。



輝駿生物10年科研服務經驗,專業提供分子互作實驗服務,包括蛋白與蛋白、蛋白與DNA、蛋白與RNA、RNA與RNA的相互作用技術,經驗豐富,實驗結果穩定可靠。

我公司自有分子、細胞和質譜實驗平臺,能執行最優的實驗路線,微量互作蛋白質譜鑒定有充足把控力,對后續功能分析有獨到見解。

我們不僅會提供專業的售前方案建議、而且售后技術支持將一直保持到文章發表,確保您安心進行下游實驗及投稿

目前,客戶已在Nature子刊、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功發表大量高分文章(點擊查看客戶文獻)





GST pull-down * 實驗流程


gst pulldown實驗詳細步驟_GST-pull down實驗技術服務外包_GST標簽蛋白.jpg


GST pull-down * 應用背景


蛋白-蛋白間的相互作用是蛋白質發揮生物學功能的主要模式,蛋白質會通過結合不同的伙伴來行駛不同的功能,形成復雜的信號轉導網絡。常見的蛋白相互作用方法主要有免疫共沉淀(Co-IP)、pull down、酵母雙雜交、熒光雙分子互補(BiFC)、熒光共定位等。


pull down技術將目標蛋白進行體外原核表達,使標簽蛋白(GST或His等)與目標蛋白融合表達,借助標簽的親和介質將目標蛋白純化出來,可以不受抗體、物種限制,比較輕松的獲得目標蛋白的結合蛋白,還可以通過外源同時表達目標蛋白和待測蛋白,確定它們是否發生直接的相互作用,或者確定兩個蛋白結合的結構域,但該方法無法得知體內真實的結合情況。


聯系技術支持
18927549347、13430303037



GST pull-down * 輝駿服務內容


 服務項目服務內容結果交付實驗周期  
客戶提供價格

GST pull down WB

(驗證型)

誘餌蛋白原核表達載體構建(選做)載體質粒、測序結果和實驗報告4-5周

誘餌基因質粒模板

實驗樣本

待測蛋白抗體

實驗信息表



誘餌蛋白原核表達和Western blot檢測誘餌蛋白Western blot檢測圖
樣本中待測蛋白的Western blot檢測待測蛋白Western blot檢測圖

GST pull down捕獲誘餌蛋白及其互作蛋白

(實驗組、空載對照組)

誘餌蛋白Western blot檢測圖

pull down實驗報告

GST pull down  MS

(篩選型)       

誘餌蛋白原核表達載體構建(選做)

載體質粒、測序結果和實驗報告

6-7周      

誘餌基因質粒模板

實驗樣本

實驗信息表

誘餌蛋白原核表達和Western blot檢測誘餌蛋白Western blot檢測圖

GST pull down捕獲誘餌蛋白及其互作蛋白

(實驗組、GST對照組、裂解液對照組)

誘餌蛋白Western blot檢測圖

pull down實驗報告

LC-MS/MS檢測及數據分析

質譜檢測結果及報告

互作蛋白篩選表格

生物信息學分析結果和報告



GST pull-down * 樣本要求


樣本類型

GST pull down WB建議送樣量

GST pull down MS建議送樣量

動物細胞3*10e7個細胞/組(約3個10cm皿)5*10e7個細胞/組(約5個10cm皿)
動物組織1g/組2g/組
植物葉片2g/組4g/組
植物根或果實4g/組
8g/組
菌體50ul菌體沉淀/組100ul菌體沉淀/組

▲注意:這里列出的均為每組樣本的送樣量,如果實驗和對照組用的樣本一致,此樣本量*2。詳細送樣指南可聯系輝駿生物客服或銷售索取。

 保存及運輸:-80℃保存,干冰取樣/運輸,至少在送樣前2天通知我司。



GST pull-down * 結果示例


GST pull down試驗服務結果分析

GST pull down WB結果圖(陽性)



GST-pull down外包實驗服務結果分析

GST Pull-down MS:Western blot檢測圖



GST pull down實驗服務費用價格實惠質量高

GST pull-down MS:質譜檢索表格(部分展示)



pull down生信分析結果.jpg

GST pull-down MS:互作蛋白生信分析結果(部分展示)


聯系技術支持
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GST pull-down服務案例—客戶文章解析


Chen S.L. et al:  A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 2018. (中科院1區,IF=13.312).


GYS2/p53負反饋環抑制HBV相關性肝細胞癌的腫瘤生長



研究概述

糖代謝異常是癌癥的突出特征,作者前期研究發現肝細胞癌(HCC)中糖原含量降低,并與患者總體生存情況不良相關,探索HCC中的異常糖代謝機制或許可以為肝細胞癌的治療提供新靶點。本研究首次報道了HCC組織中的糖原含量顯著降低,并與患者的不良預后相關,這歸因于新發現的HBx/GYS2/p53信號軸。低表達的GYS2促進HCC細胞增殖而非遷移,并提供了兩條獨立的證據來支持GYS2和p53之間的關系。一方面,GYS2與MDM2競爭結合p53,以穩定p53免于蛋白酶體降解;另一方面,p53以負反饋方式抑制GYS2表達和糖原含量。這些數據表明p53和GYS2可能通過平衡彼此的表達而在HCC中發揮功能。


摘要圖.png


研究路線

RNA-seq和qPCR等結果顯示HCC組織中的GYS2(糖原合成酶2)顯著下調,并與患者不良預后相關
細胞和小鼠實驗表明GYS2的缺失促進了肝癌細胞增殖和腫瘤生長
GYS2敲除細胞的RNA-seq實驗發現p53通路都受到明顯抑制
Co-IP和 GST pull down證明GYS2通過與p53的直接相互作用發揮腫瘤抑制功能
CO-IP和GST pull down實驗發現GYS2、p53和E3泛素連接酶MDM2相互作用形成復合體,GYS2與p53競爭結合MDM2來抑制p53泛素化,穩定p53蛋白水平
熒光素酶和ChIP等實驗表明p53蛋白結臺GYS2啟動子,通過p300介導的乙酰化,在轉錄水平上抑制GYS2
對HBV陽性肝中的關鍵致癌蛋白HBx的研究發現,HBx、HDAC1與乙酰化的p53相互作用,共同抑制了GYS2




GST pull down服務 * 客戶文章


1. Yu C.P. et al: Flot2 acts as a novel mediator of podocyte injury in proteinuric kidney disease. 2023. Int J Biol Sci. 2區, IF=10.75.
【研究內容】:足細胞損傷是慢性腎臟疾病(CKD)的常見標志。本研究證實Flot2在足細胞中表達,且能減少足細胞損傷。在LPS/ADR誘導腎病小鼠模型中,足細胞特異性Flot2的缺失會加重蛋白尿、足細胞損傷和腎小球病變。通過GST pull down和Co-IP實驗,發現Flot2和podocin通過SPFH結構域直接相互作用。同時還發現Flot-2是轉錄因子KLF15的直接靶點。
使用相關技術: GST pull down實驗、免疫共沉淀Co-IP


2. Chen S.L. et al: A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. 2018. Cancer Research. 1區, IF=13.312.
【研究內容】:糖原合成酶2(GYS2)在HCC中的表達明顯下調,并與糖原含量降低和不良患者預后相關。本研究利用Co-IP和GST pull down等方法證明GYS2與MDM2競爭性結合,阻止MDM2介導的p53泛素化和降解;GYS2還增強了p300誘導的p53蛋白K373/382位點的乙酰化,進而負反饋抑制了HBx/HDAC1復合物支持下的GYS2轉錄,從而限制乙肝病毒相關性肝癌的生長
使用相關技術: GST 融合蛋白、GST pulldown實驗、GST pull-down技術


3. You H. J. et al: Hepatitis B virus X protein promotes vimentin expression via LIM and SH3 domain protein 1 to facilitate epithelial-mesenchymal transition and hepatocarcinogenesis. Cell. 2021. Commun Signal. 2區, IF=8.4.
【研究內容】:波形蛋白(vimentin)在乙肝病毒X(HBX)陽性的肝癌細胞和HBV相關肝細胞癌(HCC)組織中的表達均升高。機制研究表明,HBX能夠通過LASP1增強了vimentin的表達。一方面,PI3-K、ERK和STAT3信號通路參與了LASP1介導的vimentin上調。另一方面,GST pull down方法確定了HBX直接與vimentin和LASP1相互作用,保護vimentin免受泛素化介導的蛋白降解,促進Vimentin蛋白的穩定性。

使用相關技術: GST-pull down實驗gst pull down-ms實驗,LC-MS/MS蛋白質譜鑒定


4. Wang J. et al: ENO1 Binds to ApoC3 and Impairs the Proliferation of T Cells via IL-8/STAT3 Pathway in OSCC. 2022. Int J Mol Sci. 2區, IF=6.208.

【研究內容】:α-烯醇化酶(ENO1)是一種代謝酶,與口腔鱗狀細胞癌(OSCC)淋巴轉移有關。本研究通過GST pull down MS尋找與轉移性OSCC患者術后淋巴引流液(PLD)中的ENO1相互作用的蛋白,發現了ENO1的新互作蛋白ApoC3。兩者的結合引起白細胞介素(IL)-8的產生,進而激活Jurkat T細胞STAT3信號通路,促進細胞凋亡,抑制Jurkat T細胞增殖。

使用相關技術: GST pull-down MS實驗,gst pulldown實驗,LC-MS/MS質譜鑒定




GST pull down * 輝駿服務優勢


1
近十年服務經驗,服務客戶眾多,案例發表在Nature Cell Biology、Nature Plants、Cancer Research等知名期刊上
2
對蛋白互作的篩選鑒定理解深刻,擅長針對客戶具體情況提出合適的方案建議
3
自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執行最優的實驗路線
4
自有蛋白質組學平臺,對微量CoIP實驗產物的質譜鑒定有十足的把控能力,對后續的生物信息分析有獨到的見解
5
售后技術支持將一直保持到客戶發表文章,確保客戶安心免疫共沉淀下游實驗及投稿



輝駿實力


輝駿DNA-pull down實驗技術外包服務

輝駿生物提供的GST Pull down實驗技術服務分為以下兩種:


1. GST Pull down WB,用于體外檢測誘餌蛋白與某樣本中的待測蛋白是否存在相互作用;

2. GST Pull down MS,用于體外篩選誘餌蛋白與某樣本中的哪些蛋白具有相互作用。


GST pull down檢測服務

服務項目服務內容結果交付實驗周期  
客戶提供價格
GST pull down WB構建誘餌蛋白的GST原核表達載體(可選做)載體質粒、甘油菌、測序結果和實驗報告約2周        

1、含有誘餌基因序列的質粒模板及測序文件

2、實驗樣本

3、待測蛋白抗體

4、實驗信息表(樣本信息、誘餌蛋白和待測蛋白序列)



原核表達誘餌蛋白并進行Western blot檢測Western blot檢測圖4-5周
Western blot檢測待測樣本中的獵物蛋白Western blot檢測圖

GST pull down捕獲誘餌蛋白及其互作蛋白

(2組:實驗組、空載對照組)
pull down實驗報告
Western blot檢測Pull down產物中的誘餌蛋白和待測蛋白Western blot檢測圖
GST pull down  MS       
構建誘餌蛋白的GST原核表達載體(可選做)

載體質粒、甘油菌、測序結果和實驗報告

約2周      

1、含有誘餌基因序列的質粒模板及測序文件

2、實驗樣本

3、實驗信息表(樣本信息、誘餌蛋白序列)

原核表達誘餌蛋白并進行Western blot檢測Western blot檢測圖4-5周

GST pull down捕獲誘餌蛋白及其互作蛋白

(3組:實驗組、空載對照組、裂解液對照組)
pull down實驗報告
Western blot檢測pull down產物中的誘餌蛋白Western blot檢測圖
LC-MS/MS定性檢測pull down產物的蛋白、篩選實驗組獨有蛋白(潛在互作蛋白)質譜檢索表格、互作蛋白篩選表格、檢測報告
針對互作蛋白做生物信息學分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息學分析結果和報告1周


聯系技術支持了解pull down實驗服務排期、優惠等
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GST pull down技術服務優勢*輝駿生物

1
近十年服務經驗,眾多服務案例,服務成果得到優秀期刊認可
2
對蛋白互作的篩選鑒定理解深刻,擅長針對客戶情況提出合適的方案建議
3
自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執行最優的實驗路線
4
自有蛋白質組學平臺,對微量互作蛋白的質譜鑒定有十足的把控能力,對后續的生物信息分析有獨到的見解
5
售后技術支持將一直保持到客戶發表文章,確保客戶安心進行下游實驗及投稿





GST pull down實驗服務樣本要求


1. 送樣量要求

樣本類型

GST pull down WB建議送樣量

GST pull down MS建議送樣量

動物細胞3*10e7個細胞/組(約3個10cm皿)5*10e7個細胞/組(約5個10cm皿)
動物組織1g/組2g/組
植物葉片2g/組4g/組
植物根或果實4g/組
8g/組
菌體50ul菌體沉淀/組100ul菌體沉淀/組


▲注意:這里列出的均為每組樣本的送樣量,如果實驗和對照組用的樣本一致,此樣本量*2。詳細送樣指南可聯系輝駿生物客服或銷售索取。

 


2. 樣本保存和運輸要求:


(1)樣本用PBS清洗干凈后,離心去掉液體,先放入液氮中速凍,再轉移至-80℃冰箱中保存;

(2)樣本一定要做好標記,應用油性防凍記號筆或標簽紙在管上注明樣本名稱或編號;

(3)樣本較多或需要分批做,要將樣本分裝;

(4)干冰取樣/運輸;需要至少在送樣前一天通知我方。

 




GST pull-down實驗結果示例


GST pull down試驗服務結果分析

gst pull down WB:Western blot檢測圖(陽性)


GST-pull down外包實驗服務結果分析

GST Pull-down MS:Western blot檢測圖


GST pull down實驗服務費用價格實惠質量高

GST pulldown MS:質譜檢索表格(部分展示)


pull down生信分析結果.jpg

GST pulldown MS蛋白生信分析結果示例



GST pull down實驗服務客戶文章


1. Chen S.L. et al: A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. 2018. Cancer Research. 1區, IF=13.312.
【研究內容】:糖原合成酶2(GYS2)在HCC中的表達明顯下調,并與糖原含量降低和不良患者預后相關。本研究利用Co-IP和GST pull down等方法證明GYS2與MDM2競爭性結合,阻止MDM2介導的p53泛素化和降解;GYS2還增強了p300誘導的p53蛋白K373/382位點的乙酰化,進而負反饋抑制了HBx/HDAC1復合物支持下的GYS2轉錄,從而限制乙肝病毒相關性肝癌的生長。

使用相關技術: gst pulldown測定、GST-pull down質譜分析、GST標簽蛋白



【研究內容】:Wnt/β-catenin信號在內皮細胞的血管生成活性中起重要作用。過表達實驗表明,轉錄因子Bach1過表達可抑制后肢缺血小鼠的血管生成,并抑制Wnt3a刺激的血管生成反應和人臍靜脈內皮細胞Wnt/β-catenin靶基因的表達。Co-IP實驗和gst pull-down分析表明,Bach1直接與TCF4結合,并減少β-catenin與TCF4的相互作用。研究揭示了Bach1抑制外周缺血損傷后的血管生成的作用機制,為血管生成治療或其他涉及Wnt/β-catenin通路異常調節的疾病提供了新的治療靶點。
使用相關技術: GST 融合蛋白、GST pull-down實驗、GST pull-down技術


輝駿DNA-pull down實驗技術外包服務


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GST pull-down試劑盒



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GST pull-down試劑盒產品簡介


輝駿生物的GST pull-down試劑盒能夠高效調取GST融合蛋白在各類樣本中的互作蛋白。在GST pull-down實驗前,先通過基因工程技術手段將目標基因和GST基因序列連接起來,并導入大腸桿菌中進行原核表達和純化,之后融合蛋白通過GST標簽與固相化在載體上的GTH( Glutathione)親和結合。接下來,當樣本中與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復合物混合時就可被吸附而分離。




GST pull down試劑盒組分


 試劑名稱 體積(20 Tests) 體積(40 Tests) 保存條件
 GST標簽純化樹脂 950 μL 1.9 mL 4 ℃
 裂解緩沖液(PH 7.4) 24 mL 48 mL 4 ℃
 漂洗緩沖液(5×) 70 mL 140 mL 4 ℃
 洗脫緩沖液(PH 2.0) 1.1 mL 2.2 mL 4 ℃
 蛋白酶抑制劑 600 μL 1.2 mL -20 ℃





產品優勢*輝駿生物

1、調取效率高與樹脂親和力強,可以高效純化目標蛋白及其互作蛋白;

2、適用范圍廣,優化的裂解液配方適用于動物、植物組織、微生物等各類型組織和細胞樣本

3、洗脫液適配后續Western Blot質譜(LC-MS/MS)實驗;

4、操作簡便,耗時短,適用于初學者。

gst pulldown試劑盒-操作簡便-周期短-輝駿生物.png




使用流程簡述


1. 通過原核表達系統表達帶有GST標簽的融合蛋白;

2. 在細菌上清液中加入GST標簽親和純化樹脂,4 ℃孵育2 小時;

3. 將待測樣本裂解液加入上述體系中,4 ℃孵育過夜;

4. 漂洗、洗脫得到目標蛋白及其互作蛋白復合物。




GST pull down試劑盒—客戶文章


1. Ni P.Y. et al: YBX1-Mediated DNA Methylation-Dependent SHANK3 Expression in PBMCs and Developing Cortical Interneurons in Schizophrenia. Advanced Science. 2023. IF=17.521. 

2. Chen R. et al: Lnc-GD2H Promotes Proliferation by Forming a Feedback Loop With c-Myc and Enhances Differentiation Through Interacting With NACA to Upregulate Myog in C2C12 Myoblasts. Front Cell Dev Biol. 2021, IF=6.684. 

3. Ma Y. et al: New insights into the proteins interacting with the promoters of silkworm fibroin genes. Scientific Reports. 2021, IF=4.379.



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